基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质

1、基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质         11-04-23 13:25:00     编辑：studa20                 作者：倪国新 朱镭 马小土 徐学敏 胡晓芳 刘建华 李伟【摘要】  为比较基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MA

2、LDITOFTOF)和电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱(ESIQTOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能，分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明，用MALDITOFTOF和ESIQTOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质，其中相同的蛋白质为633种;MALDITOFTOF和ESIQTOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质，其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明，两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性，将两种仪器结合使用，不仅能够显著提高蛋白质定性和定

3、量分析的覆盖率，而且可提高分析的置信度。 【关键词】  等量异位标签， 基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱， 电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱， 定性分析， 定量分析1 引 言基质辅助的激光解析电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)是目前用于多肽和蛋白质电离的两种主要方法。这两种方法在多肽离子化方面具有很大的互补性1。研究表明，MALDI 有利于碱性氨基酸残基的离子化2，ESI 有利于疏水氨基酸残基的离子化3。ESI源由于可与液相色谱分离的洗脱物在线连接，因此已成为蛋白质组学分析中广泛采用的离子化方式。但这种分析流程受到质谱分析的循环时间限制。近年来，LCMALDI技术的推广显著扩

4、展了MALDITOFTOF在高通量蛋白质组学研究中的应用范围。由于多肽洗脱峰是离线收集的，因此不受质谱分析循环时间的限制。现阶段蛋白质组学定性和定量研究主要采用“鸟枪法”(Shotgun)进行，保证定性和定量的特异性的同时提高蛋白质鉴定的覆盖率，是一个迫切需要解决的问题。定量蛋白质组学是功能蛋白质组学研究的重要组成部分。稳定性同位素标记结合在线或离线的液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)分析是目前定量蛋白质组学研究所采用的主要技术路线之一。常见的稳定性同位素标记方法包括SILAC(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)体

5、内代谢标记4、ICAT(Isotopecoded affinity tags)5、iTRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)6、体外化学标记及18O稳定性同位素标记7，8。SILAC只适合细胞培养条件下进行氨基酸掺入标记，ICAT方法只能用于含有半胱氨酸的多肽标记和两组样品间的比较。iTRAQ可高效率标记赖氨酸残基和N末端的氨基，能同时进行48种样品的比较分析，而且适用于所有来源的蛋白质样品，因此在进行多个样品分析时具有明显优势。MALDITOFTOF和ESIQTOF是iTRAQ标记样品分析中常用的仪器，这两种仪器

6、不仅采用不同的离子源，而且质量分析器构成也不同。前者的质量分析器是由两个飞行时间(Time of flight, TOF)分析器组成，后者的质量分析器则由一个四极杆和一个TOF质量分析器组成。已有研究者对上述两种仪器在大肠杆菌DNA结合蛋白质鉴定上的性能进行过比较9，但至今未见有关两种类型仪器在复杂蛋白质混合物定量分析上的性能比较报道。为了比较这两种仪器在iTRAQ标记样品分析中的性能，本实验设计利用iTRAQ标记的雌二醇刺激前后的MCF7细胞内蛋白质来评估MALDITOFTOF 和ESIQTOF的分析性能。2 实验部分2.1 仪器与试剂HP1200毛细管液相色谱系统(美国Agilent公司)

7、; QStar XL MS/MS系统、Tempo NanoLC分离点靶系统和4800 MALDITOFTOF 蛋白质分析仪(美国Applied Biosystems公司)。雌激素受体阳性(ER+)的人乳腺癌细胞株MCF7(上海市肿瘤所);RPMI1640培养基干粉、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco公司);17雌二醇(17oestradiol, E2，美国Sigma公司);蛋白浓度测定试剂Dc Protein Assay(美国BioRad公司);iTRAQ Reagent MultiPlex Kit(美国Applied Biosystems公司);HPLC级超纯水和乙腈(美国Merk公司);其

8、它试剂均为色谱纯。2.2 实验方法2.2.1 细胞培养与蛋白质抽提 MCF7细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在含5% CO2的37 孵箱中培养，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。17雌二醇用无水乙醇溶解后制成1.0 g/L的储存液，于-80 冰箱中保存备用。细胞实验分为溶剂对照组(加10 L乙醇)和10 nmol/L E2处理组。将细胞传代于2个10 cm培养皿中，待细胞生长至约50%60%聚合度时，分别加入上述试剂，继续培养24 h后，收集细胞。清空各组培养皿中的培养基后，分别用4 预冷的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，再将细胞刮下，转移至洁净的1.5 mL

9、离心管中，离心后弃上清液。每管中加入200 L 0.5 mol/L碳酸氢三乙酰胺裂解液，超声波破碎3次(每次10 s)，低温高速离心后，取上清液。测定各组蛋白的浓度后，-80 保存备用。分 析 化 学第37卷第9期倪国新等：基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质 2.2.2 蛋白质酶解与iTRAQ化学标记 每组样品取蛋白质100 g，分别置于洁净的微量离心管中，按iTRAQ标记试剂盒所提供的实验方案，进行半胱氨酸的封闭、胰蛋白酶酶解和含114，115报告基团的iTRAQ试剂标记，最后混合标记好的两组样品。2.2.3 LCQTOF分析与数据处理 标记好的混

10、合多肽进行真空干燥除去有机溶剂，用1 mL 上样缓冲液(10 mmol/L KH2PO4，pH 3.0)稀释后加载到PolySulfoethyl A强阳离子交换柱(50 mm×0.32 mm, 5 m, PolyLC, Columbia, MD)上，用1 mL上样缓冲液洗去裂解和标记过程中使用的TCEP，SDS，CaCl2和iTRAQ试剂后，用含有10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 300和500 mmol/L KCl的上样缓冲液步进式洗脱柱上吸附的多肽，并分步收集洗脱下来的多肽(每个组分约500 L)，最后用离心式真空干燥装置抽干。干燥后的多肽样品用1

11、00 L含有0.1% (V/V)甲酸的2%(V/V)乙腈溶解后，用反相纳升级液相色谱电喷雾串联质谱进行分析。采用HP1200毛细管液相色谱，每份样品上样 40 L到富集柱(5 mm×0.3 mm, 5 m, Michrom Bioresources, Auburn, CA)上，用缓冲液A(含0.1%甲酸的水溶液)以10 L/min的流速脱盐10 min， 然后在线切换到反相C18分离柱(5 cm ×75 m， 3.5 m, Zorbax 300SB C18, Agilent公司)。洗脱梯度为： 2%10%的缓冲液B(含0.1%甲酸的90%乙腈)2 min，然后在80 min

12、内升高到50%缓冲液B以洗脱多肽，分流前后的流速分别为160 L/min和250 nL/min。从反相色谱柱洗脱出的多肽通过在线连接的QStar XL MS/MS系统进行串联质谱分析。分析在信息依赖性获取模式(Information dependent acquisition mode, IDA)下进行。在IDA模式下，先进行m/z 3501700范围的全扫描，然后选择其中离子强度最高的4个离子峰进行二级子离子扫描。子离子谱图在m/z 1002000范围内累加2 s，Q2设置为增强所有离子模式，动态排除采用±150 ppm的容许范围，排除时间设定为2 min。将用AnalystQS 1.1 软件采集到的质谱分析数据导入基于Paragon算法10的ProteinPilot 2.0软件(Applied Biosystems公司), 对IPI数据库(IPI_HUMAN335.fasta)进行检索鉴定蛋白，报告置信度在95%(Protscore 1.3)以上的蛋白质，同时