多重耐药大肠埃希菌16SrRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因研究

1、多重耐药大肠埃希菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因研究【摘要】 目的 了解多重耐药大肠埃希菌(ECO)氨基糖苷类药物耐药机制。方法 采用PCR检测20株多重耐药ECO菌11种16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷类修饰酶基因。结果 1株检出16S rRNA甲基化酶基因(5.0%)，并为新亚型；16株检出氨基糖苷类修饰酶基因(80.0%)。15号株rmtB基因测得序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库(GenBank)已登录的rmtB氨基酸不同，为新亚型。结论 本组多重耐药ECO菌氨基糖苷类耐药机制与产16S rRNA甲基化酶和产氨基糖苷类修饰酶相关。多重耐药ECO菌存在新的氨基糖苷类药物耐

2、药机制。 【关键词】 大肠埃希菌； 16S rRNA甲基化酶； 氨基糖苷类修饰酶 ABSTRACT Objective To investigate mechanism of aminoglycoside resistance in multidrugresistant Escherichia coli. Methods The genes of 11 kinds 16S rRNA methylase and aminoglycosidemodifying enzymes were detected by polymerase chain reaction (PCR). Results In

3、20 strains, 1 strain carried 16SrRNA methylase gene (rmtB), 16 strains were positive for the genes of aminoglycosidemodifying enzymes. There were changes of aminoacids in the sequence of RmtB of No.15. A significant difference was found from the rest that landed in GenBank, which identified itself a

4、s new subtype. Conclusion The aminoglycoside resistance mechanism of the Escherichia coli was closely related with 16S rRNA methylase and aminoglycosidemodifying enzymes. The new mechanism of aminoglycoside resistance was discoved in multidrugresistant strains of Escherichia coli. KEY WORDS Escheric

5、hia coli; 16S rRNA methylase; Aminoglycosidemodifying enzymes 大肠埃希菌(ECO)是条件致病菌，对内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物呈多重耐药性。有关ECO菌耐药机制研究，国内报道内酰胺类耐药机制较多，报道氨基糖苷类耐药机制较少，并仅限于6种氨基糖苷类修饰酶基因存在情况14。近年来，国外学者发现了氨基糖苷类耐药新机制16S rRNA甲基化酶(编码基因为rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA)58。为尽可能了解淮安市第一人民医院ECO菌临床分离多重耐药株氨基糖苷类药物各种耐药相关基因存在状况，我们检测了16S rRNA甲

6、基化酶与氨基糖苷类修饰酶基因rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、armA、aac(3)I、aac(3)II、aac(6)Ib、aac(6)II、ant(3)I和ant(2)I，现报告如下。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 20株ECO菌株均分离自2007年17月间淮安市第一人民医院住院患者标本。标本来源分别为尿液7株、痰液5株、血液5株、脓液3株；患者年龄275岁，男7例、女13例。全部菌株均使用VITEK32全自动微生物鉴定系统鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922。 1.2 抗菌药物敏感性试验 用KB法测定18种抗菌药物的敏感性。根据美国CLSI 2006年版标准进行敏感性

7、判断。头孢哌酮/舒巴坦参照头孢哌酮。20株多药耐药临床分离ECO菌对18种抗菌药物的敏感性见表1。 1.4 细菌处理 挑纯培养菌落置0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200l)，56水浴2h，改95水浴10min，加入Chelex100 40l，离心(15000r/min)30s，上清液即为基因检测的模板液，-20冰箱保存备用。 1.5 基因检测 全部采用PCR法，靶基因引物序列和目的产物长度见表2。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5mmol/L， dNTPs各200表1 20株ECO菌18种抗菌药物的敏感性表2 靶基因PCR引物序列总反应体积2

8、0l(其中模板液5l)。PCR扩增产物500bp热循环参数均为：93预变性2min，然后9360s5560s7260s，循环35周期，最后一个72延长至5min。PCR扩增产物500bp热循环参数均为：93预变性2min，然后9330s5530s7260s，循环35周期，最后一个72延长至5min。扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶电泳成像仪下观察，并纪录结果。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。 1.6 阳性基因测序 PCR直接全自动荧光法(在美国ABI公司3730型仪上进行)。 2 结果 20株ECO菌中rmtB基因阳性1株(5.0%

9、)；aac(3)II、aac(6)Ib、ant(3)I基因阳性分别为15株(75.0%)、8株(40.0%)、3株(15.0%)，共有16株检出氨基糖苷类修饰酶基因(80.0%)。20株ECO菌对氨基糖苷类药物耐药的各种相关基因存在状况见表3。15号株测得rmtBDNA序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的rmtB氨基酸序列比较(Escherichia coli，登录号：ABW87619)，氨基酸序列98%相同，能判断为新亚型，已命名为rmtBlike并登录于美国核酸库(登录号：EU409593)。图1为15号株氨基酸序列比较图。 3 讨论 氨基糖苷类药物自20世纪40年代首次发现以来，因其

10、抗菌谱广、疗效卓越，在医学临床和畜牧兽医业得到广泛应用。但由于泛用和过度使用氨基糖苷类药物耐药问题随之凸现，细菌对该类药物耐药是通过表316S rRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶15号株测得rmtB DNA序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的rmtB氨基酸序列比较产氨基糖苷类修饰酶、细菌16S rRNA甲基化酶(编码基因为rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA)和氨基糖苷类药物作用靶位16S rRNA基因(16S rDNA)突变或核糖体蛋白编码基因突变所致以及细菌药物外排泵表达增强所致9，10，其中产氨基糖苷类修饰酶为主要原因。氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷

11、酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)旧称腺苷转移酶(AAD)三类，目前已发现的有30余种。本研究20株ECO菌株中检出rmtB 16S rRNA甲基化酶基因；检出aac(3)II、aac(6)Ib和ant(3)I三种氨基糖苷类修饰酶基因，并以aac(3)II和aac(6)Ib为主。 本组13株庆大霉素和/或阿米卡星耐药菌均检出1种以上氨基糖苷类修饰酶基因；1株庆大霉素和阿米卡星霉素均敏感者未检出氨基糖苷类修饰酶基因；另有3株庆大霉素和/或阿米卡星耐药者均未检出氨基糖苷类修饰酶基因，原因可能是药物作用靶位16SrRNA基因(16S rDNA)突变或核糖体蛋白编码基因突变所致或细菌药物外排泵表

12、达增强所致。 过去，药物学家通过改造老的氨基糖苷类药物的结构改善产氨基糖苷类修饰酶细菌的抗菌效能11，12，如在卡那霉素分子中引入保护基团以免修饰酶的修饰(如阿米卡星)；或是去除易被修饰酶修饰的基团(如地贝卡星)；或是两者同时采用(如阿贝卡星，阿贝卡星能拮抗大多数的修饰酶)。现在发现16S rRNA甲基化酶在细菌间快速传播将堵住通过改造老的氨基糖苷类药物的结构以拮抗修饰酶和提高抗菌作用开发新药的路子。因此16S rRNA基因甲基化酶所致的氨基糖苷类药物耐药应引起国内同行的足够关注。 16S rRNA甲基化酶在东亚(日本、韩国、我国台湾)、欧洲和南美均有报道13。最近，我国动物医学专家报道了从猪

13、分离到的阴沟肠杆菌中发现的rmtB14。日前我国从多药耐药鲍曼不动杆菌中查出armA型16S rRNA甲基化酶15，本文从ECO菌查出rmtB型16S rRNA甲基化酶为国内首次，并为新亚型。我国ECO菌临床连续分离株16S rRNA甲基化酶存在状况值得深入研究。 研究提示，本组ECO菌氨基糖苷类耐药机制与产16S rRNA甲基化酶和产氨基糖苷类修饰酶相关。当然仍不能排除同时伴有氨基糖苷类作用靶位16S rRNA基因突变或核糖体蛋白编码基因突变以及存在多药外排机制。【参考文献】 1 王家平，王苏建，张晓梅，等. 大肠埃希菌内酰胺酶、质粒AmpC酶与I类整合酶基因研究J. 中华医院感染学杂志，2

14、007，17(10)：12011203.2 张洁，包其郁，张洪勤，等. 多重耐药性大肠埃希菌质粒谱与ESBLs基因型分析J. 中国抗生素杂志，2006，31(4)：198201.3 胡龙华，贾坤茹，余方友，等. 大肠埃希菌产PER1型超广谱内酰胺酶的研究J. 中国抗生素杂志，2006，31(12)：729732.4 李智山，周乐翔，赵建忠，等. 大肠埃希菌新的氨基糖苷类修饰酶基因研究J. 中华医院感染学杂志，2007，17(8)：914916.5 Galimand M, Courvalin P, Lambert T. Plasmidmediated highlevel resistance t

15、o aminoglycosides in Enterobacteriaceae due to 16S rRNA methylation J. Antimicrob Agents Chemother,2003,47(8):25652571.6 Wachino J I, Yamane K, Shibayama K, et al. Novel plasmidmediated 16S rRNA methylase, RmtC, found in a Proteus mirabilis isolate demonstrating extraordinary highlevel resistance ag

16、ainst various aminoglycosides J. Antimicrob Agents Chemother,2006,50(1):178184.7 GonzlezZorn B, Catalan A, Escudero J A, et al. Genetic basis for dissemination of armA J. J Antimicrob Chemother,2005,56(3):583585.8 Doi Y, Adams J M, Yamane K, et al. Identification of 16S rRNA methylaseproducing Acine

17、tobacter baumannii clinical strains in north America J. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(11):42094210.9 糜祖煌. 细菌耐药的分子机制J. 临床儿科杂志，2005，23(7)：422424.10 王蓓，王长娴，糜祖煌，等. 淋病奈瑟菌对大观霉素耐药性及耐药基因J. 江苏医药，2005，31(5)：340341.11 陈代杰. 微生物药物学M. 上海，华东理工大学出版社，1999,402403.12 戈梅，陈代杰. 细菌耐药性机制的研究与新药开发 I：细菌产生钝化酶的耐药机制与新药研究J. 国外医药(合成药生化药制剂分册)，2001，22(2)：6769.13 Yamane K, Wachino J I,Suzuki S, et al. 16S rRNA methylaseproducing, Gramnegative pathogens, Japan J. EID,2007,14(4