PMSF及常用试剂的配制方法

1、英文全称： Phenylmethanesulfonylfluoride 中文名称：苯甲基磺酰氟 分子式： C7H7FO2S分子量： 174.19CAS 号： 329-98-6PubChem号：4784结构示意图：分类：OrganicChemicalsSulfurCompoundsSulfonesPhenylmethylsulfonylFluoride使用介绍：10mg/ml 溶于异丙醇（或无水乙醇）中；在室温可保存一年 ,一般保存在 -20 度或 4 度 .；工作浓度：17174ug/ml （0.11mM），储存液浓度为100或200mM; 在水液体溶液中不稳定， 30分钟就会降解一半，必须在

2、每一分离和纯化步骤1）抑制丝氨酸蛋白酶 （如胰蛋白酶， 胰凝乳蛋白酶， 凝血酶）和巯基蛋白酶 （如 木瓜蛋白酶）；2）3）4）5）中加入新鲜的PMSF,样品处理超过1h,补加一次。（见水分解，使用前加入） 【注意事项】1. PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收 后有致命危险。 为了安全和健康， 请穿实验服并戴一次性手套操作。 一旦眼睛或 皮肤接触了 PMSF,应立即用大量水冲洗之。凡被 PMSF污染的衣物应予丢弃。2. PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。3. PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25C的失

3、活速率 高于4C。pH值为8.0时，20卩mmol/lPMSF水溶液的半寿期大约为 85min，这 表明将PMSF溶液调节 为碱性（PH8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予 以丢弃。PMSF的储存：28C可以存放数月之久。欲长期保存，可冻存在 -20C例:100 mMPMSF称量0.174gPMSF（针状结晶固体）溶于10ml异丙醇，震荡混匀，保存在-20度或4度. 工作浓度我一般用 1mM,1:100（V/V）加入即可.样品处理超过1h,补加一次.（PMSF剧毒，为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作.PMSR严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一

4、旦眼睛或皮肤接触了PMSF应立即用大量水冲洗之。）PMSF在水溶液中的活性丧失速率随 pH值的升高而加快，且 25C的失活速率高于 4C。pH 值为8.0时，20卩mmol/lPMSF水溶液的半寿期大约为 85min，这表明将PMSF溶液调节 为碱性（pH8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml （10mmol/L），分装成小份贮存于-20C。女口 有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L ）。常用试剂的配制：1、30%丙烯酰胺(1)配制方法：将29G丙烯酰胺和1gN , N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的水中

5、，加热至37r溶解之，补加水至终体积为100ml,用Nalgene滤器(0.45um 孔径)过滤除菌，查证该溶液的 pH 值应不大于 7.0，置之不理棕色瓶中保存于 室温。( 2)说明：小心丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具螺 积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。 可认为聚丙烯酰胺无 毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子， 在丙烯酰胺贮存 液中加入大约 0.2体积的单床混合树脂( MB-1Mallinckrodt )，搅拌过夜，然后 用 Whatman1 号滤纸以纯化之。 在贮存期间， 丙

6、烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化 成丙烯酸和双丙烯酸。2、10%过滤酸铵(1)配制方法：把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4C 保存数周。3、1mol/L 氯化钙(1) 配制方法：在20ml纯水中(Milli-Ce水或相当级别的水)溶解54gCacl2?6H2O 用0.22um滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20Co(2) 说明：制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用纯水稀释至100ml，用 Nalgene滤器(0.45um孔径)过滤除菌，然后聚冷至 0Co4、1mol/L 二硫苏糖醇( DTT )(1) 配制方法：用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶

7、解3.09gDTT,过滤 除菌后分装成 1ml 小份贮存于-20 C o(2) 说明：DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。5、0.5mol/LEDTA (pH8.0)(1) 配制方法：在800ml水中加入186.19=水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?2H2O)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至 8.0 (约需20gNaoh颗粒)然后定容至1L,分装后高压灭菌备用。(2) 说明：EDTA二钠盐需加入NaoH将溶液的pH值调至接近8.0时，才能完 全溶解。回到页首6、10mg/ml 溴化乙锭(1) 配制方法：在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全

8、 溶解，然后用铝箔包裹容光焕发器或转移至棕色瓶中，保存于室温。(2) 说明：小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。这些溶液使用后应按附录E提供的方法之一进行净化处理。7、100mmol/LIPTG配制方法：IPTG为异丙基硫式-P -D-半乳糖苷(分子量为238.3D)，在8ml蒸 馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22um滤器过滤除菌，分装 成 1ml 小份贮存于 -20Co8、1mol/L 硫酸酶(1)配制方法：在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L,过滤 杀菌。9、p巯基乙醇(BME )

9、(1)配制方法：一般得到的是 14.4mol/L 溶液，应装在棕色瓶中保存于 4C；( 2)说明： BME 或含有 BME 的溶液不能高压处理10、酚 /氯仿(1)配制方法：一般得到的是14.4mol/LTris?CI (pH7.6)抽提几次以平衡这一 混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/LTris?Cl (pH7.6)液层， 保存于 4C。( 2)说明：小心，酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护 镜，穿防护服。 所有操作均应在化学通风橱中进行。 与酚接触过的皮肤部位应用 大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。11 、 10mmol/L 苯甲基磺酰氟(

10、PMSF)(1) 配制方法：用异丙醇溶解 PMSF成1.74mg/ml (10mmol/L)，分装成小份 贮存于-20C，如有必要可配成浓度高达 17.4mg/ml的贮存液(100mmol/L )。(2) 说明：小心：PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触3PMSF,应立即用大量水冲洗PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于 4C。之。凡被 PMSF 污染的衣服应予丢弃。 PMSF 在水溶液中不稳定，应在使用前从 贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为 35分钟(James, 1978

11、)， 这表明将PMSF溶液调节为碱性(PH8.6)并在室温放置数小时后，可安全地予 以丢弃。回到页首12、磷酸盐缓冲溶液( PBS)(1)配制方法：在800ml蒸馏水中溶解8gNacl、0.2gKcl、1.44gNa2HPO4和 0.24gKH2PO4,用HCL调节溶液的pH值至7.4加水定容至IL,在1516f/in2( 1.034 X 105Ps)高压下蒸汽灭菌20分钟，保存于室温。13、乙酸钾溶液(用于碱裂解)(1)配制方法：在 60ml5mol/L 乙酸钾溶液中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml 水， 即成钾浓度为3mol/L，而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。14、3mol/

12、L 乙酸钠(1)配制方法：在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH值至 5.2或同稀乙烯调节pH值至7.0,加水定容到1L,分装后高压灭菌。15、5mol/L 氯化钠(1)配制方法：在800ml水中溶解292.2gNacl加水定容至1L ,分装后高压灭菌。16、 10%十二烷基硫酸钠( SDS)(1) 配制方法：在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68C助溶，加入 几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水定容至1L，分装备用。(2) 说明：SDS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴口罩，称量完毕后要清 除残留在称量工作区和天平上的 SDS，10%SDS溶液无须灭

13、菌。回到页首17、20 X SSC(1)配制方法：在800ml水中溶解175.3gNacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/LNach溶液调节pH值至7.0加水定量至1L,分装后高压灭菌。18、100%三氯乙酸(1)配制方法：在装有500gTCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100% (W/V) TCA。19、1mol/LTris(1)配制方法：在800ml水中溶解121.1gTris碱，加入浓HCL调节pH值至所 需值。)HHCL7.470ml7.6?60ml8.0?42ml应使溶液冷至室温后方可最后调定 pH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。(2)说明：如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。尽管多种类型的电级均不能准确测量 Tris溶液的pH值，但仍可向大多数厂商购得适 合的电极。Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高 C, pH值大约降低.03 个单位。例如：0.05mol/L的溶液在5C、25C和37C时的pH值分别为9.5、8.9 和 8.6。20、Tris缓冲液溶液(1)配制方法：在800ml蒸馏水中溶解8gNacl、0.2Kcl和3gTris碱，加入0.0