硫酸氨基葡萄糖对IL-1β诱导人骨关节炎软骨细胞合成IL-1

1、硫酸氨基葡萄糖对IL-1诱导人骨关节炎软骨细胞合成IL-1型受体和IL-1Ra的影响(1)】 目的 研究硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）对IL-1诱导体外培养的人骨关节炎软骨细胞合成HOC中型白介素1受体（interleukin-1 receptor type ，IL-1R）和白介素1受体抗体（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）的影响。方法 取10例骨关节炎患者行全膝关节置换术的股骨髁和胫骨平台软骨标本，酶消化法获取软骨细胞进行体外培养。在原代或第二代的人软骨细胞培养液中加入IL-1（5ng/ml）和不同浓度的GS（

2、2mmol/L，10mmol/L，20mmol/L）作用24h，应用ELISA法检测GS对IL-1诱导HOC合成白介素1受体抗体，应用RT-PCR法检测HOC中型白介素1受体（interleukin-1 receptor type ，IL-1R）的mRNA表达。 结果 IL-1刺激软骨细胞合成IL-1Ra增加（P0.01），合成IL-1R mRNA下降（P0.05）。与对照相比，2mmol/L和20mmol/L的GS均能抑制IL-1刺激软骨细胞表达IL-1R mRNA下调(P0.01），而且这种修饰以浓度依赖的方式起作用(P0.01），而0.2mmol/L的GS不能影响IL-1下调IL-1R

3、mRNA的表达(P0.05）。单独使用20mmol/L的GS对软骨细胞表达IL-1RmRNA无影响(P0.05）。0.2mmol/L、2mmol/L和20mmol/L的GS对IL-1刺激软骨细胞合成IL-1Ra均无影响(P0.05）。结论 硫酸氨基葡萄糖能够拮抗IL-1对人骨关节炎细胞合成IL-1R的向下调节，但不影响IL-1Ra的表达；这可能是硫酸氨基葡萄糖能保护软骨的机制之一。【关键词】 骨性关节炎；硫酸氨基葡萄糖；软骨细胞；IL-1R【Abstract】 Objective To study the effects of glucosamine sulfate modulating IL

4、-1 induced expression of IL-1Ra and IL-1R in human osteoarthritic chondrocytes cultured in vitro. Methods Chondrocytes were harvested from ten OA patients undergone TKR operation and cultured in monolayer cultures. Human recombinant IL-1（5ng/ml）and GS in different concentrations （2mmol/L，10mmol/L，20

5、mmol/L）were administrated into culture medium of the firstorsecond passage cells. IL-1Ra in the culture medium was evaluated by ELISA，and IL-1R mRNA expression was examined by RT-PCR.Results Stimulation of human osteoarthritic chondrocytes with IL-1 for 24 hours resulted in significant enhanced prod

6、uction of IL-1Ra (P0.01) and decreased expression of IL-1R mRNA (P0.05). Pretreatment with 2mmol/Lor20 showed a dose-dependent inhibition of IL-1 induced down regulation of IL-1R mRNA expression (P0.01) while 0.2 mmol/L GS had no such effect(P0.05）. GS did not affects expression of IL-1Ra，either(P0.

7、05）.Conclusion GS inhibits IL-1 induced down regulation of IL-1Rexpression in human osteoarthritic chondrocytes. Our result reveals the possible mechanism of GS as a symptom and structure modifying drug in the treatment of OA.骨关节炎是老年人最常见的关节疾病，它以软骨结构破坏为特征，最终导致关节功能障碍。致炎因子IL-1和它作用于软骨细胞和滑膜细胞产生的其他炎性介质，干预

8、了细胞外基质的转化，加速了软骨基质的降解，诱发软骨细胞凋亡1，被认为是骨 关节炎中诱发和维持软骨损坏的关键因子2。IL-1的炎症效应通过细胞浆内IL-1型受体来介导。IL-1型受体虽然也能与IL-1结合，但作为被裁切过的蛋白，它不能产生信号；白细胞介素1受体拮抗物（IL-1Ra）能与型受体特异结合，但没有类白细胞介素1的活性。因此，调节IL-1Ra 和IL-1型受体的合成就成为阻断IL-1的炎症效应靶标之一3。氨基葡萄糖（硫酸或盐酸）(glucosamine sulfateorchloride，GS)是治疗骨性关节炎的常用药，它具有保护软骨的特性，并被认为能修复损伤的软骨。但就目前为止，它在体

9、内、外作用机制均不详。本研究拟通过观察硫酸氨基葡萄糖是否影响IL-1诱导人骨关节炎软骨细胞合成IL-1型受体和IL-1Ra来探讨GS的作用机制。1 材料与方法 材料 3-硫酸氨基葡萄糖，购自Sigma公司。胰蛋白酶、型胶原酶、DMEM培养基、胎牛血清和Trizol Reagent购自Gibco公司。重组人IL-1beta、反转录试剂盒A3500购自 Promega公司。IL-1Ra ELISA试剂盒购自R&D公司。PCR引物由北京赛百盛生物工程公司合成。CO2培养箱，丹麦Heto。酶标仪，美国BIO-RAD。PCR仪，美国Perkin Elmer，GeneAmp9600，基因测定仪、凝胶成像系

10、统和计算机图像分析系统，美国Pharmacia Biotach。电泳槽，美国Bio-Rad。 软骨细胞培养 10例原发性骨关节炎住院患者（平均年龄67.3岁），行全膝关节置换术切割下来的股骨髁和胫骨平台标本，在预冷的无菌PBS液中将软骨修剪成0.1mm3大小，0.25%的胰蛋白溶液37水浴中孵育30min，离心弃上清后加入0.2%胶原酶溶液，37恒温摇床中孵育6h以上。应用DMEM培养液冲洗收获的细胞3次，计数，以2105/ml的细胞密度接种于25cm2培养瓶中，加入含20% FCS的DMEM 5ml，放入37含5%的CO2的细胞培养箱中培养。 实验分组和给药方法 取培养的第二代细胞按5105

11、/ml的密度接种在25cm2培养瓶或六孔板中，随机分组，细胞生长至80%汇合时更换培养液为不含FCS的DMEM，让细胞饥饿过夜，然后同时加入IL-1（5ng/ml）和不同浓度的GS（2mmol/L，10mmol/L，20mmol/L）作用24h，离心，重复取上清后冷冻（-70）备用（检测PGE2），细胞用以提取RNA或裂解蛋白。 ELISA法检测软骨细胞上清中IL-1Ra含量 按试剂盒求操作，每孔各加入待测细胞上清液200l，在450nm处测吸光度（OD）值，在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应人IL-1Ra含量。王晓滨，黄公怡，薛庆云，孙常太【摘】目的研究硫酸氨

12、基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）对IL-1诱导体外培养的 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。 RT-PCR法检测IL-1R mRNA的表达水平 Trizol法提取细胞总RNA。取总RNA 2g逆转录。PCR反应条件为：94预变性5min，然后95，45s；55，45s；72，90s，-actin(上游引物 5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，下游引物5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3)

13、进行20个循环，IL-1R mRNA (上游引物5-CCAGGAGAAGAAGAGACACGGATG-3，下游引物5-CAGGACACAGCGGTAATAGCCAGC-3)进行30个循环，72延伸5min。图像分析：取5l PCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳。目的条带的吸光度V=平均吸光度值条带面积，IL-1R的表达强度Rv值=VIL-1R/Vactin。 统计学处理 应用SPSS10.0统计学分析软件，计量资料结果以均数标准差（xs）表示，多组数据间比较应用one-way ANOVA和Student-Newman-Keuls q检验，P0.05为差异具有显著性。2 结果 GS对软骨细胞合成IL-

14、1Ra的影响 如表1所示，与对照相比，IL-1刺激软骨细胞合成IL-1Ra增加，其差异具有非常显著性（P0.01）。0.2mmol/L、2mmol/L和20mmol/L的GS对IL-1刺激软骨细胞合成IL-1Ra均无影响(P0.05）。 表1 GS对人骨性关节炎软骨细胞合成IL-1Ra的影响注：n=10，IL-1Ra以均数标准差表示，与对照组比较，P0.01；与IL-1组比较，#P0.05 GS对软骨细胞中IL-1R mRNA表达的影响 如表2和图1所示，在人骨性关节炎软骨细胞中，IL-1R mRNA呈低水平表达。与对照相比，IL-1刺激软骨细胞表达IL-1R mRNA下降，差异具有显著性（P

15、0.05）。2mmol/L和20mmol/L的GS均能抑制IL-1刺激软骨细胞表达IL-1R mRNA下调(P0.01），而且这种修饰以浓度依赖的方式起作用(p0.01）。而0.2mmol/L的GS则不能影响IL-1下调IL-1R mRNA的表达(P0.05）。但单独使用20mmol/L的GS对软骨细胞表达IL-1RmRNA无影响(P0.05）。表2 GS对人骨性关节炎软骨细胞中IL-1R mRNA表达的影响注：n=10，IL-1R mRNA的Rv值以均数标准差表示，与对照组比较，P0.05；与IL-1组比较，#P0.05；*P0.05；*P图1 GS对IL-1诱导的人骨关节炎软骨细胞中COX

16、-2 mRNA表达的影响Fig1 RT-PCR showed the effect of GS on IL-1-induced expression of COX-2 mRNA (305bp) in HOC(control:-actin，539bp): Lane1 control; Lane2 IL-1; Lane3 IL-1 GS(0.2mmol/l); Lane4 IL-1 GS(2mmol/l); Lane5 IL-1 GS(20mmol/l); Lane6 GS(20mmol/l)3 讨论与类风湿性关节炎相比，骨性关节炎被认为是一个相对的非炎症疾病，即骨性关节炎累及的软骨并未显示出红、

17、肿、热、痛的标准炎症表现。然而，最近的研究表明，体外致炎基因（包括NO合成酶、COX-2、IL-1、TNF、IL-6和IL-8等）的超诱导作用导致炎性介质自发分泌，对软骨细胞的功能有破坏作用4，5。这种被称为分子炎症的反应，主依赖于IL-1的自分泌，它诱导和维系着软骨细胞稳态、软骨基质合成的失平衡状态。作为造成关节损坏的主致炎因子，IL-1在骨性关节炎和类风湿性关节炎滑液中浓度均升高，且在骨性关节炎软骨中高水平表达6。与正常组织相比，骨性关节炎软骨中IL-1转化酶表达增加，骨性关节炎软骨细胞表达IL-1受体增加而且对IL-1的作用更敏感7。IL-1通过诱导软骨细胞大量基因表达而大大改变了关节生

18、理和软骨代谢。抗IL-1治疗在实验动物模型中已证实有效避免了软骨和骨的损耗，这表明了它在骨性关节炎发病机制中的关键作用8。目前，抑制致炎因子IL-1的合成与活性，已成为缓解骨性关节炎的炎症和软骨降解的靶向之一。体内有两种白细胞介素1的天然拮抗剂：白细胞介素1受体拮抗物（Interleukin-1 Receptor Antagonist，IL-1Ra）和白细胞介素1型受体（Interleukin-1 Receptor Type ，IL-1R）。IL-1Ra能与IL-1受体特异结合，当它与滑膜细胞或软骨细胞的IL-1R结合时，就抑制了IL-1诱导滑膜细胞或软骨细胞分泌前列腺素PGE2和组织降解酶类

19、9。自然界有两种IL-1的受体，IL-1的炎症效应通过细胞浆内IL-1R型受体来介导。IL-1R虽然也能与IL-1结合，但作为被裁切过的蛋白，缺乏胞浆活性域，不能产生生物反应信号9，10。通过捕捉IL-1，IL-1R就能调节IL-1的浓度和效应，这种特性使得IL-1R成为阻断IL-1的信号传导通路的靶向之一11。本研究中，IL-1能够诱导人骨性关节炎软骨细胞合成IL-1 Ra增加（P0.05），表明IL-1Ra的活性与疾病的活动度正相关，这与文献报道血浆中IL-1Ra浓度与关节炎病损指数成正比的结论一致11。加入GS后，IL-1Ra的产生量没有变化（P0.05），表明GS不能修饰软骨细胞合成I

20、L-1Ra。Jouvene等11报道骨性关节炎的发展伴随着IL-1R合成下降，而且它在破坏性关节炎患者的体内水平低于非破坏性关节炎体内。我们也发现，与正常对照相比，加入IL-1后，人骨性关节炎软骨细胞合成IL-1RmRNA减少（P0.05）。鉴于骨关节炎软骨内IL-1的mRNA和IL-1上调、IL-1RmRNA下调，说明低浓度的IL-1在一个骨关节炎长期病程中起着加重炎症、破坏软骨代谢稳态的作用。我们的研究表明，在IL-1存在的前提下，氨基葡萄糖能够上调人骨性关节炎软骨细胞IL-1RmRNA的表达，增加IL-1R的合成量，减少IL-1与IL-R的结合，从而抑制IL-1与靶细胞的结合，调节其生物

21、效应。基因功能分析表明内源性可溶性的Il-1R（sIl-1R）可以削弱IL-1的以下作用：对软骨细胞蛋白多糖合成的抑制，诱导软骨细胞和滑膜细胞合成PGE2、NO，以及分泌基质金属蛋白酶10。因此，我们认为GS上调IL-1诱导的人骨性关节炎软骨细胞合成IL-1RmRNA是GS拮抗IL-1的致炎效应从而缓解软骨降解具有软骨保护的机制之一。4 结论王晓滨，黄公怡，薛庆云，孙常太【摘】目的研究硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）对IL-1诱导体外培养的 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考

22、学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。硫酸氨基葡萄糖能够拮抗IL-1对人骨关节炎细胞合成IL-1R的向下调节，但不影响IL-1Ra的表达；这可能是硫酸氨基葡萄糖保护软骨的机制之一。 【参考文献】1 Blanco FJ，Ochs RL. Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide. Am J Pathol，1995，146:75-85.2 Karaan PM，Berg WB. Anabolic and destructive mediators in osteoarthritis. Curr Opin Clin Nutr M

23、etab Care，2000，3:205-211.3 Jouvenne P，Vannier E，Dinarello C，et al. Elevated levels of soluble interleukin-1 receptor type and Interleukin-1 receptor antagonist in patients with chronic arthritis: correlations with markers of inflammation and joint destruction. Arthritis Rheum，1998，41:1083-1089.4 Pin

24、cus T. Clinical evidence for osteoarthitis as an inflammatory disease. Curr Rheumatol Rep，2001，3:524-534.5 Abramson SB，Attur M，Amin AR，et al. Nitric oxide and inglammatory mediators in the perpetuation of osteoarthritis. Curr Rheumatol Rep，2001，3:535-541.6 Karaan PM，Berg WB. Anabolic and destructive mediators in osteoarthritis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2000，3:205-211.7 Blanco FJ，Ochs RL. Chondrocyte apoptosis ind