登革2型病毒04株5′和3′末端的序列分析

1、登革2型病毒04株5和3末端的序列分析    登革2型病毒04株5和3末端的序列分析    中华实验和临床病毒学杂志 2000年第1期第14卷 论著    作者：杨敬杨佩英秦鄂德胡志君于曼欧武仝莉莉赵卫    单位：杨敬（100850北京，军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室）；杨佩英（100850北京，军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室）；秦鄂德（100850北京，军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室）；胡志君（100850北

2、京，军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室）；于曼（100850北京，军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室）    关键词: 登革热病毒；基因；序列分析    【摘要】目的测定登革2型病毒04株(D2-04)基因组5和3末端序列。方法从D2-04感染的C6/36细胞中提取总RNA，以该RNA为模板，利用RACE法，分别扩增D2-04株的5和3末端cDNA片段。将其分别与pGEM-T载体连接得到含有5端535 bp和3端503 bp cDNA的重组质粒，并测定上述cDNA插入片段的序列。将D2-04的5和3端非编码

3、区的核苷酸序列与其它登革2型毒株进行同源性比较。结果D2-04株与JAM、NGC、S1、16681和PDK-53株的同源性分别为98.96%，98.96%，93.75%，98.95%，97.92%和97.72%，97.80%，90.65%，94.26%，94.22%。结论D2-04株除与S1株的同源性略低外，其余株的同源性均在94%以上。    Sequence analysis of the 5and 3terminal regions of dengue type 2 virus 04 strain    YA

4、NG Jing, YANG Peiying, QIN Ede, et al.    （Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China）    【Abstract】ObjectiveTo analize the sequences of 5 and 3 terminal region of dengue type 2 virus 04 strain. Meth

5、odsTotal RNA was isolated from dengue type 2 virus 04 strain (D2-04) infected C6/36 cells. With this RNA as templete, the cDNA of both 5 and 3 termini of D2-04 were amplified using RACE method respectively. The cDNAs were separately inserted into pGEM-T vector and the recombinant plasmids containing

6、 the 5 terminus 535 bp and 3 terminus 503 bp were obtained. The nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment were determined. The nucleotide sequences of the 5 and 3 noncoding regions of D2-04 were compared with other Dengue type 2 viruses such as JAM、NGC、S1、16681 and PDK-53. ResultsThe results

7、 showed that they shared 98.96%,98.96%,93.75%,98.95%,97.92% and 97.72%,97.80%,90.65%,94.26%,94.22% homology with D2-04 strain respectively. ConclusionExcept S1, the homology between D2-04 and other type 2 viruses was higher than 94%.    【Key words】Dengue virus; Gene; Sequence ana

8、lysis    登革2型病毒04株(D2-04)的非结构蛋白NS2ANS5基因核苷酸序列已测定1。5非编码区(5-NCR)长约96100个核苷酸，3非编码区(3-NCR)长约400600个核苷酸，含有病毒全长正链和负链RNA合成的启动子序列2，并与病毒的复制密切相关。因此我们又对D2-04的5和3末端的核苷酸序列进行了测定并与其它登革2型毒株的同源性进行了比较。    1材料和方法    1.1病毒的培养及RNA的提取病毒株D2-04株及其感染C6/36细胞总RNA的提取见

9、文献1。    1.2引物设计与合成根据已发表的登革2型标准株新几内亚C株(NGC)的基因组序列3，利用Goldkey软件设计引物。5端设计两条反向引物Sp1和Sp2,3末端设计一条正向引物Sp3(表1)。    表1登革2型病毒基因组5及3端引物序列及位置    Tab.1Genome 5 and 3 primers of dengue type 2 virus used for PCR       &#

10、160;    引物    Primer    位置    Position    核苷酸组成(53)    Nudectide sequence(53)            Sp1    6816

11、63    GGTACACGTCCCATAAGTT            Sp2    503480    CTTTTCCCTTTCTCTTGTCTACTG            Sp3    101

12、8910210    ATAGGCAATGAGGAATACACAG            1.3RT-PCR扩增采用RACE快速扩增cDNA末端方法扩增D2-04的5和3末端。方法参照5/3 RACE kit说明书(Boehringer Mannheim)，所用寡聚d(T)锚定引物核苷酸组成为：5-GACCACGCGTATCGATGTCGAC(T)16V-3(V=A,C或G)，PCR锚定引物的核苷酸组成为：5-GACCACGCGTATC

13、GATGTCGAC-3。    1.3.15 RACE取总RNA，加入cDNA合成缓冲液，dNTP混合物，AMV反转录酶，特异引物Sp1(12.5 M)，加水至总体积20 l,55， 60 min进行反转录。反应完毕，65，10 min灭活反转录酶，所得cDNA利用PCR产物纯化试剂盒(Boeheinger Mannheim)进行纯化。取纯化的cDNA样本加入10×反应缓冲液和dATP，94变性3 min，以消除二级结构，冰浴后加入末端转移酶，37，10 min，在cDNA的3端加上poly A尾。70，10 min灭活末端转移酶。取含poly

14、 A尾的cDNA，加入寡聚d(T)锚定引物，特异引物Sp2(12.5 M),dNTP,10×反应液和Taq plus (Sangon)聚合酶，补水至总体积50 l,混匀后进行PCR扩增。反应参数为：94，2 min后，94，15 s；55，30 s；72，40 s进行10个循环，再94，15 s;55,30 s;72,60 s,2个循环，94,15 s;55,30 s;72,80 s,4个循环，94，15 s;55,30 s;72,100 s，6个循环，94，15 s；55，30 s；72，120 s,8个循环。最后一次循环后，72延伸7 min。   

15、 1.3.23RACE取总RNA，加入10×poly A聚合酶缓冲液(500 M Tris.Cl,pH7.9,2.5 M NaCl,100 mM MgCl2，25 mM MnCl2)，poly A聚合酶(GibcoBRL),ATPNa2(25 mM)(Boheringer Mannheim),RNasin(GibcoBRL),BSA(Promega)，加水至总体积35 l，37，30 min在RNA的3端加上poly A尾。用GlassMax核酸纯化试剂盒(GibcoBRL)纯化poly(A)RNA。取纯化的poly(A)RNA,分别加入dNTP，寡聚d(T)锚定引物，AM

16、V反转录酶，加水至总体积20 l，混匀后55，60 min进行反转录。反应完毕，65，10 min灭活cDNA，取cDNA加入PCR锚定引物，特异引物Sp3,dNTP及10×反应液和Taq plus (Sangon)聚合酶，补水至总体积50 l，混匀后进行PCR扩增。反应参数为：94，1 min后，94，60 s，62，60 s，72，90 s进行25个循环，最后一次循环后，72延伸7 min。    1.4PCR产物的克隆测序PCR纯化试剂盒(Bohringer Mannheim)纯化的PCR产物直接与pGEM-T载体(Promega)连接，

17、转化感受态DH5，挑取阳性克隆，ABI 377全自动测序仪测序。2结果    2.15和3端cDNA克隆的测定采用5/3 RACE法扩增出如预期大小的特异的片段。经纯化的PCR产物直接与pGEM-T载体连接，转化感受态DH5，用菌落PCR法从平板生长的菌落中筛选出5和3端cDNA阳性转化子(图1)。        M:PCR marker;1:5端PCR扩增产物；2：pGEM-T-5的PCR产物；3：3端PCR扩增产物； 4：pGEM-T-3的PCR产物  

18、;  1RACE法扩增D2-04 5和3端结果    Fig.1Amplified fragments of 5 and 3 termini of D2-04 by RACE method    M:PCR marker. 1:PCR product of 5 terminus. 2:PCR product of pGEM-T-5.3:PCR product of 3 terminus. 4:PCR product of pGEM-T-3    2.25和

19、3端序列5端非编码区的核苷酸数为96个，开放读码框架从97位的ATG开始(图2)。3端非编码区有454个核苷酸，其中有20个核苷酸的重复序列(图3)。        图2D2-04 5端核苷酸序列    Fig.2The nucleotide sequence of 5 tenminus of D2-04        注：下划线为非编码区核苷酸序列    

20、3D2-04 3端核苷酸序列    Fig.3The nucleotide sequence of 3 tenminus of D2-04    Note:The underlined part represents the    nucleotide sequence of noncoding region    2.3与其它病毒一级结构同源性比较利用Goldkey软件将D2-04株5-NCR和3-NCR分别与其它登革2型病毒(JAM

21、、NGC、S1、16681和PDK-53)核苷酸序列的同源性进行比较(表2)。    表2D2-04 5-NCR和3-NCR与其它登革2型病毒核苷酸序列的同源性    Tab.2Nucleotide sequence homology of D2-04 5-NCR and 3-NCR with other dengue type 2 viruses              &

22、#160; JAM    NGC    S1    16681    PDK-53            5-NCR    98.96    98.96    93.75 

23、0;  98.95    97.92            3-NCR    97.80    97.72    90.65    94.26    94.22     

24、       结果表明，D2-04株5-NCR与S1株核苷酸序列的同源性最低，与其它登革2型毒株的同源性相似。S1株的3-NCR的核苷酸数为443个，比其它2型毒株少11个，将其空余部分补齐后，D2-04再与它进行同源性比较，它们之间的同源性为90.65%。    3讨论    本文采用RACE法对D2-04株的5和3末端核苷酸序列进行了测定。RACE法即快速扩增cD-NA末端法，也称锚定PCR法(A-PCR)，用于扩增5和3末端未知序列4，5，

25、可准确测得全长的未知序列，而常规的5和3末端序列测定方法为根据已知序列设计引物，扩增所需片段，再进行克隆和序列测定，这种方法测得的末端序列为已知引物的序列，而不是未知序列。由此可见，RACE法比常规方法有很大优越性，尤其适用于扩增未知序列。    D2-04株基因组RNA的5末端序列中有相连的寡聚T和寡聚A，它们之间易配对形成茎环状二级结构。锚定引物中有16个相连的T，因此易与序列中的寡聚A配对，往往造成序列测定时5端少约100个核苷酸。我们通过测定多个克隆，获得了理想结果。    登革病毒基因组RNA的3末端无p

26、olyA结构，我们先利用polyA聚合酶在3末端加上polyA尾，再与含寡聚dT的引物配对扩增3末端。这种方法对3末端不含polyA尾病毒末端核苷酸序列的测定有借鉴意义。    登革病毒的5-NCR和3-NCR可形成茎环状二级结构。3-NCR二级结构中包含一个长的茎和环，紧接一个短的茎和环(3-SL)，3-SL是由基因组3末端93个核苷酸形成，参与病毒的复制6。若设计针对5和3-NCR的反义核苷酸，可用于抑制病毒的复制，因此，我们对D2-04株5和3末端核苷酸序列的测定，为抗病毒药物的研究奠定了基础。    作者单位：欧武（100850北京，军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室）    参考文献    1，杨敬，胡志君，杨佩英，等.登革2型病毒04株非结构蛋白NS2ANS5基因的cDNA克隆及序列分析.中华微生物学和免疫学杂志，2000(待发表).    2，Stollar V,Schlesinger RW