白藜芦醇对缺氧环境中鼻咽癌细胞株CNE2的化疗增敏作用

1、白藜芦醇对缺氧环境中鼻咽癌细胞株CNE2的化疗增敏作用    中国 作者：权芳, 张少强, 白艳霞, 姚小宝, 李宏慧, 于良, 潘承恩 【摘要】 目的：观察缺氧环境下白藜芦醇（resveratrol，Res）提高人鼻咽癌细胞株CNE2对化疗药物敏感性的作用并探讨其机制。方法：将不同浓度白藜芦醇加入化疗药物干预过的CNE2中，低氧培养48 h，甲基噻唑基四唑法检测CNE2中白藜芦醇对化疗药物的逆转倍数，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，应用反转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹法检测CNE2细胞中多药耐药相关基因1(multidrug resistance gene

2、 1，mdr1)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance?associated protEin 1，MRP1)和缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF?1）mRNA和蛋白水平的表达变化。结果：缺氧环境下白藜芦醇对化疗药物具有协同增效作用，200 mol/L白藜芦醇对紫杉醇的逆转倍数为2.58。25、50、100和200 mol/L白藜芦醇与紫杉醇合用，使紫杉醇诱导的CNE2细胞凋亡增加，且表现出明显的浓度依赖效应。此外伴着白藜芦醇浓度的增加，mdr1、MRP1和HIF?1的表达显著降低，加用白藜芦醇组与不加白藜芦醇组比较，差异有统计学

3、意义（P<0.01）。结论：白藜芦醇可以通过下调核转录因子HIF?1及多药耐药相关基因mdr1、MRP1的表达提高缺氧环境中鼻咽癌细胞株CNE2对化疗药物的敏感性。 【关键词】 白藜芦醇; 化疗增敏; 缺氧; 鼻咽癌Methods: Human CNE2 nasopharyngeal carcinoma cell line was cultured under hypoxic conditions (37 , 5% CO2, 2% O2) in vitro. The cultured cells were treated with different concentrations of

4、resveratrol for 48 h. Reversal fold (RF) of reseratrol to chemotherapeutic drugs in CNE2 cells was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Apoptotic rate of CNE2 cells was observed by flow cytometry. Reverse transcription?polymerase chain reaction (RT?PCR) method and Western blotting w

5、ere used to investigate the expressions of multidrug resistance gene 1 (mdr1), multidrug resistance?associated protEIn 1 (MRP1) and hypoxia inducible factor 1 (HIF?1) in CNE2 cells.Results: Resveratrol combined with chemotherapeutics produced a synergistic effect. The RF of 200 mol/L resveratrol to

6、paclitaxel was 2.58. Combined with paclitaxel, 25, 50, 100 and 200 mol/L of resveratrol increased the apoptotic rate of CNE2 cells from (22.14±1.09)% to (23.24±1.37)%, (27.57±2.01)%, and (30.36±2.31)%, respectively. Resveratrol could down?regulate the expressions of HIF?1, mdr1 a

7、nd MRP1 significantly. After being treated with resveratrol at different concentrations separately, the expressions of HIF?1, mdr1 and MRP1 in CNE2 cells decreased significantly as compared with paclitaxel alone or paclitaxel plus verapamil (P<0.01).Conclusion: Resveratrol can enhance the sensiti

8、vity of CNE2 cells to chemotherapeutic drugs under hypoxia. The potential mechanism is partly attributed to inhibiting the gene expressions of HIF?1, mdr1 and MRP1.Keywords: resveratrol; chemotherapy sensitization; hypoxia; nasopharyngeal carcinoma鼻咽癌是 中国 南部及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一。实体瘤内存在的大量对射线敏感性下降和化疗药物耐药的

9、乏氧细胞，是肿瘤放、化疗失利，肿瘤复发和再生长的根源。深化探讨鼻咽癌乏氧细胞耐药产生的机制，寻找有效增敏剂或增敏方法已成为当前临床 治疗 的热点课题。白藜芦醇（resveratrol，Res）是广泛存在于葡萄、花生和多种传统中药中的一种多酚类化合物，具有降血脂，抗炎，抗氧化，抑制肿瘤细胞增殖、转移和促进凋亡等生物学功能，是近年中西医结合领域的一个研究热点。本实验室研究发现白藜芦醇对多药耐药的KBv200细胞具有化疗增敏作用1。本研究将在前期实验基础上，探讨Res对缺氧条件下鼻咽癌细胞株CNE2细胞的化疗增敏作用并通过紫杉醇研究其机制。 1 材料与方法 1.1 试剂和仪器 三气培养箱(NU495

10、0型)，美国NUAIRE公司产品；荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪(7000型)，美国ABI公司产品；GIS凝胶成像系统，上海天能公司产品；FACsort流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。白藜芦醇、紫杉醇和四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT），购自美国Sigma公司；顺铂，购自香港科鼎药业；5?氟尿嘧啶，购自浙江海正药业股份有限公司；TRIzol试剂、SupperScript逆转录试剂盒、PCR试剂盒、兔抗人磷酸化缺氧诱导因子1（hypoxia inducible fa

11、ctor?1alpha，HIF?1）多克隆抗体、鼠抗人P?糖蛋白（P?glycoprotein，P?GP）单克隆抗体、鼠抗人多药耐药相关基因1(multidrug resistance gene 1，mdr1)单克隆抗体、鼠抗人多药耐药相关蛋白1（mulidrug resistance?associated protein 1，MRP1）单克隆抗体，购自晶美生物工程有限公司；Annexin?异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡试剂盒，购自美国Oncogene公司。1.2 MTT法检测白藜芦醇对

12、缺氧环境中CNE2的化疗增敏作用 人鼻咽癌细胞CNE2，购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库。CNE2细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液内，置37 ，含5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，23 d换液一次。当细胞生长达到铺满70%80%时，以0.25%的胰蛋白酶?0.03% EDTA溶液消化，通常按照135的比例传代，每周传代两次，当细胞传至810代时进入实验。1.2.1 确定增敏的药物浓度 搜集对数生长期的CNE2细胞制成单细胞悬液(1×106个/mL)，接种于96孔板

13、，每孔100 L。培养24 h后加入25、50、100、200、300 mol/L白藜芦醇，另设不加药物的对照组及不含细胞的空白组，共7组，每组设5个重复孔，加药后置于三气培养箱中低氧培养（2% O2，5% CO2，93% N2）。培养48 h后MTT方法检测，并 计算 各浓度的增殖抑制率。绘制细胞增殖抑制曲线，选取抑制率20%的低细胞毒性或无细胞毒性浓度作为增敏浓度。实验重复4次。1.2.2 逆转倍数的测定 按上法接种细胞，培养24 h后加入白藜芦醇及化疗药物。白藜芦醇为上述实验中确定的增敏浓度，化疗药物为紫杉醇，顺铂及5?氟尿嘧啶3种，均按110逐级稀释的方式在104109 mol/L间分

14、6个浓度组，另设对照组及空白组，每组设5个重复孔。加药后培养48 h，测570 nm吸光度值，计算细胞存活率，参照 文献 2确定半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50），实验重复3次。按以下公式计算逆转倍数（reversal fold，RF）: RF=IC50A/IC50B。其中IC50A和IC50B分别为缺氧下白藜芦醇作用前后CNE2细胞对化疗药物的IC50值。1.3 实验分组 确定白藜芦醇IC50后，将生长状态良好的人鼻咽癌细胞系CNE2细胞常氧培养24 h后分6组。（1）紫杉醇8 nmol/L（设为不加白藜芦醇的阴性对照组）；（2）紫杉醇8 nmo

15、l/L+维拉帕米10 mol/L（阳性对照组）；（3）紫杉醇8 nmol/L+25 mol/L白藜芦醇；（4）紫杉醇8 nmol/L+50 mol/L白藜芦醇；（5）紫杉醇8 nmol/L+100 mol/L白藜芦醇；（6）紫杉醇8 nmol/L+200 mol/L白藜芦醇。加药后置于三气培养箱中低氧(2% O2，5% CO2，93% N2)培养48 h。实验重复5次。1.4 Annexin?FITC/PI双标记法检测CNE2细胞凋亡 离心搜集6组细胞，按照Annexi?FITC/PI试剂盒说明书处理待测细胞。用4 预冷的PBS洗细胞2次，结合缓冲液去离子水14稀释。用250 L稀释的结合缓冲

16、液重新悬浮细胞，并使其浓度为1×106/mL。取100 L细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 L Annexin?FITC和10 L 20 g/mL PI溶液。混匀后于室温避光孵育15 min。在反应管中加入400 L PBS，流式细胞仪检测。所有数据经CellQuest 1.2软件分析。1.5 RT?PCR检测mor1、MRP1和HIF?1 mRNA的表达 按TRIzol操作说明，分别提取6组CNE2细胞总RNA，紫外分光光度计定量，调整RNA质量浓度为1 g/L。RNA样品经反转录反应合成cDNA第一链，然后进行PCR扩增。经预实验，将逆转录的cDNA稀释10倍为模板。引物想象m

17、dr1（473 bp）正义引物：5?CTG TCA GTG TAT TTT CAA TGT TTC G?3；反义引物：5?AAT TTT GTC ACC AAT TCC TTC ATT A?3。MRP1（440 bp）正义引物：5?TCT ACT TCT TCG TCC AGA GGT TCT A?3；反义引物5?CTC AGT CTC TGA ATA CTC CTT GAG C?3。HIF?1（359 bp）正义引物；5?CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA G?3；反义引物：5?CTA GAT TTG CAT CCT TTT ACA AGT T?3。?actin（160 bp)正义引物：5?AGA ACA TCA TCC ATG CAT CCA?3；反义引物：5?GCC TGC TTC ACC ACC TTC TTG?3。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。总反应体系为25 L：10×Reaction buffer（MgCl2 15 mmol/L）2.5 L，dNTP Mix（10 mmol/L）1 L，5和3引物（10 mol/L）各0.5 L，Taq DNA聚合酶（5 U/L）0.5 L，cDNA 1 L，ddH2O 19 L