应用定量PCR方法快速基因诊断Down综合征

1、    应用定量PCR方法快速基因诊断 Down综合征        【摘要】目的探讨用定量聚合酶链反应方法对Down综合征进行基因诊断。方法以短串联重复序列(D21S11)作为遗传标记，合成特异引物，用同位素标记聚合酶链反应扩增后对11名正常人(6例外周血，5例羊水)及28例Down综合征患者(外周血)进行定量检测。结果11名正常人中10人出现DNA含量为11关系的2条电泳带，1人为1条带。28例患者中24人出现DNA含量21的2条带，3人为DNA含量为111的3

2、条带，1人为1条带。结论D21S11位点短串联重复序列多态是对Down综合征基因诊断很有应用价值的遗传标记，应用定量聚合酶链反应方法可在24小时内对Down综合征做出快速、准确的产前及临床基因诊断。【关键词】Down综合征定量聚合酶链反应基因诊断 Rapid detection of trisomy 21 by quantitative polymerase chain reactionJIN Chunlian*,ZHANG Li, WANG Ruomei, YU Hai,JIANG Li, LIN Changkun, LI Fuchai, SUN Kailai.*Department of

3、Medical Genetics, China Medical University, Shenyang 110001 P.R.China. E-mail:Klsun IRIS.CMU.EDU.CN【Abstract】ObjectiveStudying gene diagnosis of trisomy 21 by means of quantitative polymerase chain reaction.MethodsPolymorphic short tandem repeat(STR) at D21S11 served as the gene marker, and a pair o

4、f primers was synthesized. The samples from 11 normal subjects and 28 cases of trisomy 21 were analyzed by quantitative PCR.Results10 normal subjects showed two bands with a ratio of 11, and a subjects showed one band. Of 28 cases of trisomy 21,24 cases showed two bands with a ratio of 21,3 cases sh

5、owed three bands with a ratio of 111, and 1 case showed one band. Conclusion Polymorphic STR at D21S11 is a valuable gene marker for diagnosis of trisomy 21.Trisomy 21 can be diagnosed rapidly and accurately within 24 hours by quantitative PCR.【Key words】Down syndromeQuantitative polymerase chain re

6、actionGene diagnosis先天愚型(Down syndrome,Down综合征)是一种最常见的染色体病，以先天性智力低下为主要症状。主要由于21三体或易位引起q22-ter部分三体所致，其发病率为1/7001/800。目前临床主要采用常规染色体显带技术，能对大多数患者进行诊断，但所需时间长(约23周)，方法较繁琐，尤其在产前诊断中，羊水细胞不易培养，不便于大规模的产前普查。1993年国外报道1，2，采用短串联重复序列(short tandem repeat,STR)作为遗传标记，通过荧光标记PCR结合DNA自动分析仪检测，可对Down综合征做出快速的基因诊断，但此方法所需仪器较昂

7、贵。为此，我们选用D21S11位点STR多态作为遗传标记，应用放射性标记PCR定量方法，探讨Down综合征快速、准确基因诊断的可行性。1材料和方法1.1材料28例Down综合征患者及6名正常人外周血，由中国医科大学第一临床学院遗传室、第二临床学院细胞遗传室以及儿保门诊经临床染色体核型分析诊断后提供，28例Down综合征患者核型均为21三体型。5份正常羊水(孕620周)由中国医科大学第二临床学院妇产科提供。1.2方法用饱和氯化钠法提取血液白细胞DNA，煮沸法提取羊水脱落细胞DNA3，4。PCR反应总体积5 l，含基因组DNA 0.1g，引物0.5 mol/L，dNTP100 mol/L。-32P

8、-dCTP 37037Bq，Taq DNA聚合酶0.2 U，经9445秒，5835秒，7245秒，31周期循环后，72延伸7分钟，扩增后加入20 l 1×甲酰胺变性示踪液(95%甲酰胺EDTA，0.05%二甲苯蓝，0.05%溴酚蓝)，97变性10分钟，取24 l至6%变性聚丙烯酰胺凝胶(7 mol/L脲素，ACgBis为191，1×TBE)30 80W电泳分离1.52小时，-70放射自显影612小时。所用引物参照文献5的方法合成。2结果2.1D21S11位点STR多态检测结果11名正常人和28例Down综合征患者中共检测到7个等位片段，片段长度约为220bp250bp，见1

9、。1D21S11位点STR多态等位片段中可见AG7个等位片段，6、7为正常人，其它均为患者Fig 1STR polymorphic allele fragment at D21S11Seven polymorphic allele fragments (A to G),6 and 7 are normal persons and others are patients2.211名正常人中10人均为D21S11位点STR多态杂合子，1人为纯合子。2.328例Down综合征患者D21S11位点STR多态检测结果24人为有2个不同长度等位片段的杂合子，3人为有3个不同长度等位片段的杂合子，1人为有1

10、个等位片段的纯合子，见2。2D21S11位点定量PCR检测结果1：患者(111)；24、6、7、9：患者(21)；5：患者(纯合子)；8：正常人(11)Fig 2Quantitative PCR detection at D21S111:patient(111);2-4，6，7，9：patient(21)；5：patient(homozygote);8:normal person(11)2.4正常人及Down综合征患者等位片段经DNA密度仪定量结果见表1。表1D21S11位点STR等位片段定量结果Tab 1Quantitative results of STR polymorphic alle

11、le fragments at D21S11Sample(样本)Number of samples(样本数)Quantitative ratio of twobands of the heterozygote(杂合子两条带之间的定量比)Heterozygote(杂合子)Homozygote(纯合子)Mean(均数)Standarddeviation(标准差)Range(范围)Normal diploid(正常二倍体)101.0940.0811.0071.255Trisomy 21(21三体)1-Two bands(2条带)241.9120.1871.6212.226Three bands(3条

12、带)3-One band(1条带)1-3讨论 90年代初，国外一些学者提出用定量PCR方法可对染色体数目畸变做出基因诊断。这种方法是以特定染色体靶序列的扩增为基础的，即在PCR扩增过程的指数增长阶段，扩增产物的量与最初靶DNA的量成比例关系。选择某一染色体上特定序列作为遗传标记进行PCR扩增，通过测定扩增产物量就能确认细胞中存在这一特定染色体数目，从而诊断出染色体数目的畸变2。Eggeling等1，5分别选S100B(21号染色体)和IGFI(12号染色体作内对照)作为遗传标记，应用荧光标记技术和DNA自动分析仪定量分析相结合的方法，探讨用PCR方法快速诊断Down综合征的可行性，后来Adin

13、olfi等6进一步探讨了应用STR遗传标记进行Down综合征快速诊断的可行性。STR是定量PCR检测染色体数目异常最适合的遗传标记6，它广泛存在于人类基因组内，且呈高度多态性，可提供信息量(PIC)较高，并遵循孟德尔共显性遗传等特点。我们选择的D21S11位点STR为TCTA四核苷酸重复序列多态，它位于21q21，与Down综合征核心区紧密连锁。分析了11名正常人和28例Down综合征患者，共检测到7个等位片段，其长度为220bp250bp。Mclnnis等7报道分析535名正常人和患者，共检测到12个等位片段，与我们的结果有一定差异，这可能与我们检测的标本数少有关。我们检测到的实际杂合子率为

14、94.8%(37/39)。分析的11名正常人D21S11位点STR结果，10人均出现2个扩增带，经DNA密度仪定量2条带的比率近似11(1.094)。只有1例是纯合子，即只出现1条扩增带。Down综合征患者28例中3例呈3条带，扩增的DNA量呈111，24例呈现2条带，其密度比率近似21(1.912)，仅有1例呈现1条带，即3个等位基因纯合型。本研究结果表明，应用该多态位点定量PCR方法能对96.4%(27/28)的Down综合征作出诊断，而且扩增的2条等位片段可互为对照，肉眼观察就能判定与密度仪器定量(21)基本一致的结果。我们应用同位素-32P-dCTP标记PCR扩增法结合DNA密度仪扫描

15、定量，能简便快速定量诊断，与荧光标记PCR扩增后DNA自动分析仪分离并定量方法相比较，所用成本低，仪器设备简单，能直观地肉眼判定，更具有推广应用意义。我们体会到，同位素掺入法的PCR循环周期数非常重要，是定量可靠的关键，在本实验条件下扩增循环31周期较为理想。Pertl等5报道，在荧光标记结合DNA自动分析仪定量检测76例患者中，有1例呈现不规则的峰，可能系患者为嵌合型所致。定量PCR方法的不足在于对嵌合体不能做出准确诊断，我们所选择的标本都是21三体型，因而未遇到这种异常的带型，但在实际应用中不能忽视这一点。本课题受辽宁省科委(96802002)资助作者单位：金春莲于海姜莉林长坤李福才孙开来

16、（110001沈阳，中国医科大学医学遗传学教研室）王若梅（第一附属医院儿科）张励（中国人民解放军大连医学高等专科学校生物教研室）*为通信联系人参考文献1Eggeling F, Fregtag M, Fahsold R,et al.Rapid detection of trisomy 21 by quantitative PCR.Hum Genet,1993,91(6)567-570.2Pertl B, Yau SC, Sherlock J, et al.Rapid molecular method for prenatal detection of Down's syndrome. L

17、ancet,1994,343(8907)1197-1198.3林长坤，姜莉，张励，等.一种实用的基因组DNA提取方法及应用.中国医科大学学报，1998，27(4)440-441.4Kogan SC,Doherty M, Citschier J,et al.An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequence. N Engl J Med,1987,317(16)985-990.5Pertl B, Kopp WS, Kroisel PM,et al.Rapid detection of trisowis 21 and 18 and sexing by quantitative fluoescent multiplex PCR.Hum Genet,1996,98(1)55-59.6Adinolfi M, Sh