共聚焦操作流程

1、实验环境观察仪器是否有外表明显损坏，如需开启空调，一般控制在25度。拉上窗帘，避免标本荧光淬灭及杂光干扰。开机20分钟以后才能再开启,查看实验记录，确认是否马上能开机（注意：汞灯必须在关机般为30分钟）。确认后可执行以下操作：（务必先开电源，后开钥匙！ ！）。1、打开PSU（主电源）2、打开激光器（只开启需使用的激光器）1） 、氩离子多线激光器 （458/488/515，应用染料：GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP 等）。2）MCPSU半导体综合激光器（LD405应用染料：DAPI/Hoechst/BFP等；LD635应用 染料：CY5/ Alexa647 等）。3

2、） LD559激光器（注意：电源打开后不要马上开钥匙，等待TEMP指示灯不闪烁后，再开钥匙，红色指示灯不闪烁后，可正常使用）。3、打开显微镜电源IX2-UCB4、 打开荧光汞灯（注意：开启后，“ 15分钟内勿关”）UserID: Administrator5、 打开电脑主机、显示器，登陆windows xp系统'' -，双击共聚焦软User ID: Adminiwirator，打开FV10-ASW应用软件宀。三、取图1、DIC （微分干涉差）明场立体图（1）、插入起偏镜、检偏镜（DIC滑块）。（2）、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮*，打开卤素灯快门，使用TD滑块（软件

3、TD lamp项）控制卤素灯的光强，倒置显微镜下观察标本， 进行标本聚焦。1 ）、使用手控面板选择合适倍率的物镜下观察（注意若用60 x油镜时，检偏镜部位要推上弯杆）,并检查各物镜对应的DIC元件。2）、可在检偏镜部位用旋钮进行对比度的调节。（需要时可使用，一般勿调）*"，关闭卤素灯快门。打开DIC通（3）、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮 道，执行取图操作。1）、调节扫描速度至最快（2.0us/pixel）, size为512by，点击刈阳声歩，进行快速预扫，寻找焦平面。步骤：适当调节 HV、gain及ofsetGabi.仃 J仃1如1V9t%VQ1如需放大光学倍数，可适当

4、调节扫描。般为能看到图像即可），快速2）、选择AutoHV，放慢扫描速度（扫描速度越慢，扫描时间越长，图像信噪比好，但耗时，易淬火，一般为 10-12.5 us/pixel）, size为640by,点击利眄也 进行再预扫,调节HV、gain及offset参数至图象清晰尖锐即可。点击Stop，停止预扫描。Fihei Mo<i«3）、若背景噪音仍过多也可选上Kdiukrn来降低随机噪音干扰（次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，一般在HV较高时使用）。5）、去掉厂氐、皿从卄，将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度至最快,即最左端，2.0us/pixel , size为512b

5、y）,为下一个标本做好准备。2、荧光图（1）、拉出检偏镜（DIC滑块），打开汞灯机械快门（shutter ）。（2）、FV10-ASW软件中点击汞灯观察按钮 合，打开汞灯快门，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦（找视野）。使用手控面板，根据标本荧光探针选择合适的荧光虑色片及选择合适的物镜下观察，WU紫外激发/蓝色荧光（eg： DAPI）, WB蓝色激发/绿色荧光（eg： FITC EGFP，WG 绿色激发/红色荧光（eg:Texas Red Rhodamine，DsRed（一般要求标本在所用的各种荧光探 针匹配的荧光虑色片下均能观察到所需视野，eg： DAPI+ FITC+ Texas Re（

6、多色荧光探针，需在WU,WB,WG下均能观察到所需视野，DAPI 一般荧光较强，FITC或Texas Red下易找些）。（注意：更换不同倍数物镜时应适当降低物镜再更换，以免损坏物镜；若用60 x油镜时，要插入检偏镜并推上弯杆 。）（3）、FV10-ASW软件中点击汞光观察按钮，关闭汞灯快门。执行取图操作。1）、点击，添加荧光染料。（最多为三色，多于三色需分别扫描）若标本使用的荧光染料不是染料库里的染料，可选激发光及发射光谱较接近的染料代替，这时可适当调整2）、调节扫描速度至最快（2.0us/pixel）, size为512by，点击? 1":，进行快速预扫，寻找焦平面。步骤：适当调节

7、 HV、gain及ofset（一般为能看到各通道图像即可），止预扫描。快速调节寻找焦平面，如需放大光学倍数，可适当调节3）、选上（双染以上一定要选上，可避免激发光串色），选择AutoHV（ AutoHV功能为自动匹配扫描速度与HV值，不选易造成图像出现强度过饱和状态）放慢扫描速度（一般为10-12.5 us/pixel），size为640by，点击> '进行再预扫，调节HV、gain及ofset参数至图象清晰尖锐即可。点击Stop，停止预扫描。Mode（次数越多降噪越4）、若背景噪音仍过多也可选上厂贰心1"归"来降低随机噪音干扰好，但扫描时间也越长，一般在HV

8、较高时使用）。5）、点击进行取图，保存及相关图像处理。（注意：原始图像一定要保存为oib格式）nne< Mode6）、去掉L'' J，将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel， size为512by），为下一个标本做好取图准备。四、刻录数据图像保存后，退出 FV10-ASW软件，刻录数据（注意：必须用新的光盘，严禁使用U盘、移 到硬盘等）。五、关机务必先关钥匙后关电源！ !！1、关闭荧光汞灯（注意：开启后，“ 15分钟内勿关”）2、关闭激光器1）、关闭 LD559 激光器2）、关闭MCPSU半导体综合激光器3）、氩离子多线激光器 （注意：先关钥匙，千万别马上关闭电源，要等风扇停止转动后 再关闭电源）3、使用擦镜纸沾擦显微镜物镜 （ 注意：一般物镜清洗液为乙醇， 擦镜纸为普通擦镜纸； 油镜清洗液