内皮型一氧化氮合酶基因转染对人吞噬细胞释放细胞因子和生成环核苷酸的影响

1、    内皮型一氧化氮合酶基因转染对人吞噬细胞释放细胞因子和生成环核苷酸的影响        摘要目的和方法：将内皮型一氧化氮合酶基因转染吞噬细胞，观察该基因表达对吞噬细胞释放细胞因子和cAMP的影响。 结果：内皮型一氧化氮合酶可在吞噬细胞获得稳定表达，但该产物在活细胞中不产生一氧化氮。一氧化氮合酶基因表达可上调TNF-的释放，下调IL-10和cAMP的生成，使用一氧化氮合酶抑制剂不改变这种变化趋势。结论：内皮型一氧化氮合酶基因产物的功能具有细胞特异性。导致吞噬细胞功能变化的

2、效应分子可能不是一氧化氮。主题词吞噬细胞；一氧化氮；细胞活素类；腺苷环一磷酸中分类号R392.32文献标识码A文章编号1000-4718(2000)04-0304-04 Effects of endothelial nitric oxide synthase gene transfection on cytokines and cAMP production in human phagocytic cellsYAN Liang, CAI Qun(Department of Pathophysiology, Medical College of Jinan University,Guangzho

3、u 510632， China)Abstract AIM and METHOD: Human endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene was transfected into human phagocytic cell U937 and the effects of gene transfer on cytokines and cAMP production were observed. RESULTS: A functional eNOS was stably expressed in transfected U937 cells, but

4、 NO release was undetectable in intact transfectants. However, eNOS gene expression upregulated tumor necrosis factor- release and downregulated interleukin-10 and cAMP production in either presence or absence of NOS inhibitor N-monomethyl-L-arginine. CONCLUSION: The function of tranfected eNOS gene

5、 product showed cellular speciality. The effector molecule that changed the produced pattern of cytokines and cAMP in phagocytic cells seems not likely the nitric oxide.MeSHPhagocytes; Nitric oxide; Cytokines; Adenosine cyclic monophosphate一氧化氮（nitric oxide, NO）是重要的生物信息分子，是由一氧化氮合酶（nitric oxide synth

6、ase, NOS）在细胞内将底物L-精氨酸转化而成的活性氮分子。根据NOS的基因结构和在组织分布的特点，存在于内皮细胞的称为内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）。eNOS的活性有明显的钙与钙调蛋白依赖性，其产生的NO 对调节血管张力，保持正常内皮功能，防止白细胞粘附等起着重要的作用1。机体在某些病理条件下产生大量NO，可能参与感染性休克低血压的发病机制。但使用非选择性NOS抑制剂反而使病情恶化2，推测其原因之一是抑制了eNOS活性从而干扰了内皮功能。至今尚不能确定NOS在人吞噬细胞的表达，至少未见具有如同啮齿类动物吞噬细胞那样大量

7、产生NO的现象及参与杀灭致病原的功能。人的吞噬细胞与啮齿类动物的吞噬细胞在L-精氨酸代谢上也存在很大的区别35。但是，人的多形核白细胞与单核细胞均存在对NO敏感的鸟苷酸环化酶，使用外源性NO供体可使这些细胞分泌细胞因子的功能出现明显的变化6。人吞噬细胞株U937在佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）刺激下分化为单核吞噬细胞样细胞，能分泌多种细胞因子。最近发现这种细胞缺乏可溶性鸟苷酸环化酶活性，多种刺激物作用下均不产生cGMP。该细胞也不表达NOS活性，外源性NO供体通过减少细胞内cAMP的生成上调TNF-的释放7。该细胞的这些特性使其成为研究NO信息传导与吞噬

8、细胞功能关系的好材料。为此我们将人的eNOS 基因转染至U937细胞，观察其对细胞因子表达和环核苷酸信使分子cAMP生成的影响。材料和方法一、细胞培养和细胞因子测定人吞噬细胞U937购自ATCC。细胞用RPMI 1640(含25 mmol/L HEPES)10胎牛血清培养。调细胞浓度为5×105/孔于24孔培养板，每孔置1.5 mL含有100 nmol/L PMA的RPMI 1640培养48 h，用无钙、镁的Hank液洗两次，重新置于1 mL无PMA的新鲜培养基中继续培养24 h，离心取上清测定TNF-和IL-10的含量。所用的ELISA测定试剂盒为美国R&D SYSTEM产

9、品。二、eNOS 基因表达载体的构建和基因转染将含有完整开放阅读框的人eNOS 基因cDNA 从pUC19的EcoR I位点切下，连接到载体pcDNA3上以便获得Hind III/Not I克隆位点，再将带有Hind III/Not I位点的eNOS cDNA 定向连接至真核细胞表达载体pCEP4上。pCEP4载体含有潮霉素选择标志，eNOS 基因由CMV启动子驱动。经部分测序证明克隆操作正确。用电钻孔的方法将含有eNOS 基因的pCEP4载体导入低密度培养过夜的U937细胞，置于含有潮霉素B的RPMI 1640(含25 mmol/L HEPES)选择培养后，得到稳定表达eNOS蛋白的转染细胞

10、(eNOS gene transfected cells, eNOS)。用同法将不含eNOS基因的空载体导入U937构建对照细胞(vector DNA transfected cells served as control, Vector)。三、蛋白印迹法鉴定eNOS蛋白离心弃上清收获细胞。将沉淀的细胞用细胞溶解液（内含蛋白酶抑制剂）溶解，沸水浴10 min 后，离心弃沉淀，上清作蛋白定量，用8%的SDS PAGE分离蛋白质，然后电转移至PVDF膜上。一抗为鼠抗人eNOS单克隆抗体，二抗为连接了辣根过氧化酶的羊抗鼠IgG （均购自美国Transduction Laboratories）。化学发

11、光反应试剂购自美国杜邦公司。四、表达产物酶活性的鉴定为确定转染细胞表达的蛋白质是否具有产生NO的酶活性， 破碎细胞成分的eNOS活性按文献3的方法（放射性同位素标记L-精氨酸转化试验）测定。活细胞的eNOS活性测定按下法进行：细胞经无钙、镁的Hanks液洗涤后，用无硝酸盐的AMEM培养基培养，分别于O，24，48和62 h取无细胞上清测定硝酸盐和亚硝酸盐(nitrate and nitrite, NOx)含量，观察NO的生成及其稳定代谢产物的积累。另外，用富含乌苷酸环化酶的RFL-6细胞(一种来自大鼠肺的成纤维细胞)为指示细胞，将转染了eNOS基因的U937细胞与之共培养，10 min后用乙醇

12、法提取cGMP，观察被NO激活的乌苷酸环化酶活性（用cGMP生成量表示）8。cGMP酶免疫测定用美国Amersham 公司提供的试剂盒进行。以上实验同时设置500 mol/L NOS抑制剂单甲基-L-精氨酸（Nmonomethy1-L-arginine, L-NMA）对照组。五、细胞内cAMP含量测定细胞先用含IBMX（1 mol/L)的无钙、镁Hanks液处理15 min，然后加入腺苷酸环化酶激动剂PGE2结果一、 eNOS在U937细胞的表达蛋白印迹实验证实转染了eNOS基因的U937细胞表达人内皮型一氧化氮合酶蛋白。由抗eNOS单克隆抗体识别的140 kD条带清晰可见，与阳性对照显示的位

13、置一致。转染载体DNA的对照细胞以及非转染细胞无此蛋白表达（1）。    Fig 1Western blot shows eNOS protein expression in transfected cells1: Positive control(HUVEC lysate)； 2: eNOS transfected U937 cell lysate；3: Vector transfected U937 cell lysate； 4: Untransfected U937 cell lysate； 5: Protein molecular weight

14、markers1 蛋白印迹实验证实转染细胞表达eNOS蛋白二、 eNOS酶活性的测定（一） 破碎细胞成分NOS活性的试管测试在测试体系中加入维持eNOS活性必需的辅助因子（Ca2+、Mg2+、钙调蛋白、NADPH和四氢生物蝶呤等），转染细胞成分表现出可被 NOS抑制剂L-NAA所抑制的NOS活性。在测试体系中分别去除Ca2+、钙调蛋白或NADPH，转染细胞成分的NOS活性消失（2）。     Fig 2Determining eNOS activity in transfectant homogenate by L-arginine conversion

15、 assay 2L-精氨酸转化试验检测破碎细胞成分的eNOS活性(二） 活细胞NOS活性的测试eNOS基因转染细胞不产生NO的稳定代谢终产物硝酸盐和亚硝酸盐(NOx)，连续观察至62 h未见NOx积累（3），与转染载体DNA的对照细胞比较无显著差异（P0.05）。eNOS基因转染细胞也不能激活RFL6细胞的乌苷酸环化酶，RFL6细胞与eNOS基因转染细胞共培养所产生的cGMP和与转染载体DNA的对照细胞共培养所产生的cGMP均处于低水平（表1）。     TreatmentWith L-NMAWithout L-NMARFL-6+Vector 2.2&#

16、177;0.22.0±0.3RFL-6+eNOS1.0±0.11.0±0.3RFL-6 only1.6±0.2RFL-6+SNP23.8±0.8*     Using NO donor sodium nitroprusside(SNP)at concentration of 50 mol/L as positive control. *P<0.01, vs all other data in Tab 1 二、 eNOS基因转染对U937细胞释放细胞因子和产生cAMP的影响eNOS基因转染细胞经PMA

17、刺激分化后TNF-的分泌明显高于转染载体DNA的对照细胞，而IL-10和cAMP的生成则明显低于转染载体DNA的对照细胞， NOS抑制剂L-NMA并不能影响这种变化趋势（表2）。TransfectantTNF-(pg/mL) IL-10(pg/mL)cAMP(fmol/5×105 cells)eNOSL-NMA (-)86±23*154±14*4371±1029* L-NMA(+)116±35*151±7*2610±219*VectorL-NMA(-)22±4322±67660±983L-NMA

18、 (+)25±5271±9 4530±444     * P0.01,vs Vector in the same treatment of using L-NMA 讨论本实验将eNOS基因转染至人的单核吞噬细胞并得到具有免疫活性和酶活性的eNOS蛋白。同时观察到eNOS基因产物的表达确实影响了吞噬细胞的功能，表现在细胞因子和环核苷酸等重要信使传导物的生成和释放发生了明显的变化。然而，本实验结果表明，基因产物的表达与功能可因转染细胞的不同而各异，虽然破碎细胞在试管检测体系中表现出酶的活性，并且具有eNOS所特有的钙、钙调蛋白和

19、NADPH依赖性，表达eNOS的活细胞却检测不出NO的生成。出现此种现象除了说明相同的基因表达产物在不同的细胞有不同的功能表现以外，可能尚有下列原因：（1）在内皮细胞，eNOS通过豆蔻酸化定位于膜性结构9，而eNOS在转染细胞中主要位于胞浆。基因表达产物处于细胞的不同部位可能影响其功能的发挥。（2）内皮细胞含有维持eNOS活性必需的辅助因子，但吞噬细胞缺乏合成四氢生物蝶呤的能力4。值得注意的是， 在U937细胞中表达的eNOS分子，虽然不产生NO，却具有上调TNF-的释放，下调IL-10 和cAMP生成的效应，其作用机制尚不清楚。本实验使用较大剂量的NOS抑制剂不能改变这种效应也从一个侧面说明

20、效应分子不是NO。合理的解释是eNOS产生了另一具有细胞信息传导功能的活性因子。根据现有的文献资料，eNOS实际上是一种钙依赖性的NADPH氧化酶，其C-端的还原酶活性域能与NADPH，FAD和FMN结合，而N-端的氧化酶活性域又能与四氢生物蝶呤和底物L-精氨酸相互作用10。eNOS的这种特殊分子结构使其既能产生NO也能产生其他活性氧分子例如超氧阴离子11。已有报道超氧阴离子等活性氧分子参与细胞增殖、分化、凋亡等生理病理过程的基因表达调控和细胞信息传递1214。是否eNOS的表达促进了吞噬细胞产生超氧阴离子等活性氧分子并由此改变了细胞因子的分泌和cAMP的生成，有待进一步深入研究。基金项目 广

21、东省科委科学基金和国务院侨办重点学科科研基金资助颜亮（暨南大学医学院病理生理教研室， 广东 广州 510632）蔡群（暨南大学医学院病理生理教研室， 广东 广州 510632）参考文献1Vallance P, Collier J, Moncada S. Effects of endothelium-derived nitric oxide on peripheral arteriolar tone in manJ. Lancet, 1989, 2(8670):9971000.2Cobb JP, Natanson C, Hoffman WD, et al. N-amino-L-arginine,

22、 an inhibitor of nitric oxide synthase, raises vascular resistance but increases mortality rates in awake canines challenged with endotoxinJ. J Exp Med, 1992, 176(4):11751182.3Yan L, Vandivier RW, Suffredini AF, et al. Human polymorphonuclear leukocytes lack detectable nitric oxide synthase activity

23、J. J Immunol 1994, 153(4):18251834.4 Schneemann M, Schoedon G, Hofer S, et al. Nitric oxide synthase is not a constituent of the antimicrobial armature of human mononuclear phagocytesJ. J Infect Dis, 1993, 167(6):13581363.5Schoedon G, Schneemann M, Hofer S, et al. Regulation of the L-arginine -depen

24、dent and tetrahydrobiopterin-dependent biosynthesis of nitric oxide in murine macrophagesJ. Eur J Biochem, 1993, 213(2):833839. 6Van Dervort AL, Yan L, Madara PJ, et al. Nitric oxide regulates endotoxin-induced TNF- production by human neutrophilsJ. J Immunol, 1994, 152(8):41024109.7Wang S, Yan L, W

25、esley RA, et al. Nitric oxide increases tumor necrosis factor production in differentiated U937 cells by decreasing cyclic AMPJ. J Biol Chem, 1997, 272(9):59595963.8Ishii K, Sheng H, Warner TD, et al. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblastsJ. Am J Physiol, 1991, 261(2 Pt2):H598603.9Busconi L, Michel T. Endothelial nitric oxide synthase, N-terminal myristoylation determines subcellular localizationJ. J Biol Chem, 1993, 268(12):84108413. 10Venema RC, Ju H, Zou R, et al. Subunit interactions of endothelial nitric oxide synthase. Comp