冻干鼠神经生长因子中试制备及几点问题的探讨

1、    冻干鼠神经生长因子中试制备及几点问题的探讨        摘要中试制备小鼠神经生长因子，将小鼠颌下腺经研磨、匀浆、离心、除脂等步骤粗提后，经CM-32柱层析、Mr 10000膜超滤、CM-sepharose Fast Flow柱等分离纯化后，平均每1000只成年雄性小鼠颌下腺可获得2.5S神经生长因子(NGF)110mg130mg，Mr为13000±2000，等电点pH 8.69.3，结果表明，此法生产的NGF纯度及比活均有所提高，并且生产流程缩短。关键词神

2、经生长因子；中试制备 Preparation of Freeze-Dry Mice Nerve Growth Factor on A Medium ScaleRen WanqiongFeng JunLiu BaoshanSong GuomingZhou Wenli（Biological and Medical Products Research Institue of Jinan Military Area,Zhumadian 463000）AbstractTo medium scale mice nerve growth factor,mice submaxillary gland&

3、127;&127;was ground, extracted,centrifugated and defatted successively,then,the mixture was purified by CM-cellulose, ultrafiltration(Mr10000), CM-sepharose.Thus 2.5S Nerve Growth Factor(NGF)was obtained.The yield of this product was 110mg130mg from 1000 male mice.The Mr was 13000±2000 and

4、the isoelectric point was 8.69.3. The result showed that puring and specific activity of NGF is higher with this method,and the production process is shorter.Key Words Nerve growth factor，Medium scaleNGF是1948年Bucker最先发现的细胞生长因子，广泛存在于动物体内，以成年雄性小鼠颌下腺中含量最高，其次是豚鼠前列腺和蛇毒中。它的理化性质、主要生物学功能均已基本阐明1，2。NGF的作用广泛，具

5、有维持交感神经和感觉神经细胞的生存，促进周围神经细胞的生长和分化，决定轴突的生长方向等作用，另外，某些中枢神经元的功能活动与NGF也有关系35。现已确认NGF是神经系统最重要的生物活性分子之一，有着广阔的临床应用前景。目前，国内尚无批量制剂的生产。我们主要参考国内学者柳川等报告的方法6，结合我们的实际情况对NGF制备工艺进行了探讨，中试制备了小鼠颌下腺2.5S NGF。1试剂羧甲基纤维素CM-32(英国Whatman公司);羧甲基纤维素CM-sepharose(Fast Flow瑞典Pharmacia公司)；两性电解质(pH310)(瑞典Pharmacia公司)；等电点标准品(上海丽珠东风生物

6、技术有限公司)；DMEM培养粉(美国Grand Island生物公司);NGF标准品(中国生物制品药物检定所)；牛血清白蛋白标准品(中国生物制品药物检定所)。2方法2.1工艺流程我们参照柳川报告的方法和有关技术资料，设计了两条工艺路线：一条基本上是按照柳川报告的方法（工艺A）；另一条是我们改进的方法（工艺B），其流程如1。Fig 1Procedure in production of NGFr 10000的膜超滤2h，将浓缩液对0.25×10-3Effluent volume(ml)Peak 1,2. Impurity Peak 3.NGF purificationFig 2Chro

7、matogram of CM-sepharose FF2.2提纯物的检定r2培养24h48h。在倒置显微镜下进行观察。根据神经元突起的生长程度来确定NGF提取物的生物活性，以突起生长最长、最密时的NGF浓度作为一个生物活性单位。比活性(BU/mg)活性(BU/ml)/蛋白浓度(mg/ml)3结果每1000只小鼠颌下腺按工艺B可得约110mg130mg NGF提取物。提取物经等电聚焦电泳，在碱侧位于等电点标准品的Lentile凝集素碱性带(pI 8.65)和胰蛋白酶原(pI 9.30)处，形成三条聚焦带（3）， 其主要成分为亚基NGF及其修饰物的混合物，包括在羧基端失去8个氨基酸残基和在氨基端失

8、去一个精氨酸残基三种组分构成的NGF称为2.5SNGF，它们的沉降系数均为2.5S，等电点略不同，从等电点标准曲线中测得等电点分别为8.9，9.15，9.3。由于样品量少，其中有一条带在脱色过程中褪去部分而不明显。1.Isoelectric point standards2.NGFFig 3Isoelectric focusing of NGF在SDS电泳上，提取物形成彼此靠近的两条带（4），其泳动距离略大于Mr为14400的-乳白蛋白，从Mr标准曲线中得出提取物的Mr在13000±2000范围内。1,3.NGF2. Mr standardsFig 4SDS-PAGE of the

9、purified NGF4讨论从成熟雄性小鼠颌下腺提取NGF的工艺已有一些资料报道。我们主要从以下几个方面对工艺进行了改进。4.1原料的处理我们在生产实践中注意到，小鼠颌下腺细胞的破碎这步很重要，它直接关系到最后NGF的收率，因此，采用冻融、低渗、研磨、匀浆四种细胞破碎方法相结合，以确保腺体细胞充分破碎而使NGF完全释放出来。4.2Mr 10000膜超滤CM32柱收集液，经Mr 10000膜超滤浓缩，2h内即可完成，与资料6报道的方法0.25×10-3mol/L的磷酸盐缓冲液透析24h相比较，不仅缩短了时间，加快了生产流程，而且减轻了NGF活性的丧失。4.3CM-sepharose

10、F F柱及sephadex G-75柱的使用2.5S NGF的纯化，文献报道的方法6为使用CM32柱，流速3040ml/h，流程1618h，上样量100只小鼠颌下腺。采用CM-sepharose Fast Flow 柱后，流速提高到600ml/h，流程3h4h，使生产流程缩短，并且交换容量大，可以此提高投产量，使投产量达到3000只小鼠颌下腺。我们设计的两条工艺路线，工艺B较工艺A所制备的NGF纯度及比活都有所提高。并且，我们根据实际工作中的情况，加了一步分子筛层析，即Sephadex G-75柱层析，使所制备的NGF纯度提高到99以上，而工艺A NGF纯度仅89。由于工艺的改进，使NGF比活

11、由 1×105BU/mg提高到8×105BU/mg。总之，经过我们改进的工艺适宜于中试制备NGF，产量比较稳定，与同类资料报道的方法6比较平均100对颌下腺所获得NGF提取物从5mg9mg增加到11mg13mg，并且流程缩短，纯度及比活均有所提高。任晚琼（济南军区生物制品药物研究所，河南驻马店 463000）冯军（济南军区生物制品药物研究所，河南驻马店 463000）刘保山（济南军区生物制品药物研究所，河南驻马店 463000）宋国明（济南军区生物制品药物研究所，河南驻马店 463000）周文丽（济南军区生物制品药物研究所，河南驻马店 463000）参考文献1，Levi-Montalcini R.The nerve growth factor thirty five years later.Science,1987, 23711544，Thoenen H,Brade YA. Physiology of nerve grouth factor.Physiol Rew ，1