优化农杆菌介导基因转化效率因子分析

1、卢瑶优化农杆菌介导基因转化效率因子分析刘彩萍,曾炳山,裘珍飞,李湘阳,刘英(中国林业科学研究院热带林业研究所繁育中心,广东广州510520)(Agrobacterium)和含有Ri质粒的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。在目前的应用中,主要以根癌农,增强农杆菌苏文潘等6在农杆菌介导橡树遗传研,外源钙的修饰改变了橡胶树胚胎组织结构,随着外源钙的增加,多糖化合物增多,刺激了细胞的分离。Mon2toro等7发现,橡胶树愈伤组织在无CaCl2培养基上预培养8一段时间后,可以提高报告基因的瞬时表达活性,从而提高转化效率。Montoro等在进行外源钙对农杆菌介导的橡胶树转基因影

2、响的试验中发现,在无CaCl2培养基上继代培养2个星期的愈伤组织,内源钙降低了91%,细胞接受外源基杆菌介导法为主1-2。与其他转基因方法相比,农杆菌介导法具有转化率高、导入植物细胞的片段确切,且导入的片段拷贝数低、表达效果好,使用的技术和仪器简单,是转基因方法中最普及、经济和有效的方法中共培养法利用比较普遍31因的活性增加。另外,培养基中其他成分如激素、有机营养物质等,都能使细胞处于活化状态,更容易接受外源基因。例如,NAA与62BA的使用可以明显提高水稻的转化效率,而ABA则明显降低转化率2侵染液制备方法的优化9。利用农杆菌介导进行林木基因转化的方法有叶圆片法、共培养法和直接接种法,其。建

3、立一个遗传转化体系,在确定了基本的技术参数指标后,需要逐步优化影响因子,从而提高转化效率。用农杆菌介导的共培养法来建立遗传转化体系时,一些基本的因子包括抗生素的确定、菌种的选择、菌液浓度、预培养时间、泡菌时间和共培养时间等,通过优化其中的一些影响因素,可以有效提高转化率,起到事半功倍的效果。笔者主要介绍和分析共培养法中可能优化的基因转化因子,为提高农杆菌介导转化率提供方法和依据。1预培养培养基的优化。侵染液的制备是农杆菌转化的关键之一,侵染液中农杆菌的活力直接关系到共培养中农杆菌的侵染能力。农杆菌液体培养方法通常有两种:一种是先通过小管培养,得到一定体积的农杆菌菌液后,转入三角瓶中继续培养到一

4、定的光密度OD值;另一种是培养到一定浓度后,用固定体积的液体培养基稀释一定的倍数到需要的光密度OD值。王文燕等10在根癌农杆菌介导LesquerellafendleriL.转化的研究中认为,农杆菌培养至一定的OD600值比重新悬浮至一定的OD600值转化率高。原因可能是直接培养的农杆菌的活性比外植体进行共培养前,一般都要在含有外源激素的培养基上预培养一段时间,目的是使植物组织代谢活跃,促进细胞分裂,分裂状态的细胞更易整合外源DNA,从而提高外源基因的瞬时表达和转化率4-5稀释重新悬浮后的农杆菌活性高,因此感染能力强。为了提高农杆菌的侵染能力,通常会在侵染液中添加一些辅助物质。AS是最多用于诱导

5、vir基因转录活化的酚类物质,已证实AS对多种植物的农杆菌诱导有效,并且AS的促进效果与菌株类型、植物材料种类和共培养培养基的pH值有关。AS的添加方法有3种:共培养培养基中添加、侵染液中添加及在侵染液和共培养培养基中同时添加,其效果视不同植物而异,而且同种外植体对于不同添加方式的效果也不同。范春节11。预培养的培养基一般是固定的,即为适合外植体再生的培养基,但是也有人认为,在预培养时降低钙的含量会促进农杆菌的侵染。钙在对致病微生物抵抗方面起到重要作用,而钙的不足会引起细胞壁结构基金项目国家林业局“948”引进国际先进农业科学技术项目(200624270)。作者简介刘彩萍(1980-),女,山

6、西宁武人,在读硕士,助理工程师,从事桉树转基因育种研究。收稿日期2009209223用尾赤桉叶片和茎段作为外植体,分别在共培养培养基、农杆菌悬浮液,以及同时在二者中都添加,试验结果表明,以茎段为外植体时,在菌液中添加100mol/L1142安徽农业科学2010年AS,转化率约为50%,而在共培养培养基中添加AS会抑制间长短视菌种和外植体种类而异。有的研究者在浸泡的基础上结合了振荡进行接种,得到了转基因植物。席梦利等21农杆菌的转化效率;以叶片为外植体时,无论是在共培养培养基中单独添加还是在菌液中单独添加都能提高转化效率,但同时添加反而效果不明显。在共培养培养基中添加100mol/LAS,转化率

7、为46.7%,而对照为20%。张晓英等12对国槐遗传转化体系的优化试验表明,国槐叶片在侵染前的菌液和共培养培养基中分别添加200mol/LAS能够提高转化频率5.35、3.32倍。也有研究者认为乙酰丁香酮在低对毛白杨遗传转化研究表明,只有将pH值调至4.85.0,加入200mol/LASpH值条件下的效果更好。郝贵霞等13在研究不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率影响的试验中,将茎段外植体进行振荡接种,经过PCR检测得到了抗性芽。振荡培养的优势在于通过振荡打破细胞表面的气泡,使农杆菌与外植体的接触面增大,有利于农杆菌侵染。近年来,在提高遗传转化效率方面发展了一些新技术,如超声波辅助农杆菌介导法(

8、SAAT:sonicationassistedAgrobacteriummediatedtransformation)、负压与农杆菌介导结合法以及基因枪与农杆菌介导结合法等,均可增强农杆菌浸染,提高转化效率,在植物遗传转化方面有较多成功的报道。1997年,Trick等22时,才能大大提高转化率。杨秀荣等14研究了乙酰丁香酮对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响,试验结果表明,在培养基pH值为5.8时加入AS,卡那霉素抗性芽的获得率为4.0%12.5%,与对照相比没有明显提高,而将pH值调至5.2后,加入AS可明显地促进甘薯的遗传转化。特别是AS的浓度为25mg/L时,卡那霉素抗性芽获得率提高到3

9、5.7%。首次采用SAAT法将外源基因转入大豆23和豇豆中,中,姜玲等,用超声波处理26.SAAT法在林木遗传转Santarém等24在将gus基因植物受伤后除了大量释放酚类物质,分子,动,编码的P10、,virA蛋白进而诱导农杆菌vir基因的表达。,采用SAAT法的转化效30%45%。可能由于超声波处理可在受体材料表皮和深层造成许多微损伤,有利于农杆菌进入组织内部,同时从伤口处分泌出较多的酚类物质,有助于提高农杆菌的转化活力,明显地提高农杆菌的感染效率。另外,Zaragoza等25将抗除草剂基因bar通过SAAT转蛋白ChvE结合,激活virA蛋白进而诱导vir基因高水平表达和扩大

10、农杆菌的寄主范围。特别在AS浓度很低的情况下,它们可强烈诱导vir基因的表达,并且与AS存在协同效应,15基因可显著提高AS诱导效果。刘斌等在反义磷脂酶D转化毛白杨的研究中,对传统的侵染液制备方法进行了改良,将已经培养好的农杆菌菌液用13倍的5%蔗糖附加一定浓度的表面活性剂稀释菌液制成侵染液,将切好的叶片置于侵染液中侵染,得到的再生芽经PCR检测为转基因芽。这种侵染液的制备方法既增加了侵染液中蔗糖的浓度,又减去了离心操作步骤,并且达到了在浸染液中附加一定量的乙酰丁香酮同样的作用,其结果比只用液体培养基稀释更好些。Hiei等16入刺槐,获得转基因植株。负压处理会在转化材料上形成许多细小的伤口,导

11、致组织液大量外流,流伤液中的酚类物质可刺激农杆菌的活力,同时大量细小伤口的形成可提高农杆菌侵染的机会瑞明2726。毕以六倍体普通小麦HB341、SN2618、TS021和四倍体22认为较低的pH值、低于28的温度、较高的渗透压、适当浓度的冠瘿碱及一些糖类等都能有效地增强基因的表达。糖类在不含酚类化合物的情况下效果较明显,但是糖类和酚类化合物同时存在时却没有明显的协同效应。多胺(Polyamines,PAs腐胺、亚精胺等)是一种生物体中广泛存在的代谢产物,是具有调控作用的低分子量脂肪族含氮碱17-18。刘志学等28以水稻愈伤组织为受体材料,在与菌液混合时辅以Tween20和负压处理,用gus报告

12、基因的瞬间表达作为指标,与仅用Tween20或仅用负压处理的样本进行了比较研究。试验结果表明,适当的负压处理可提高转化频率,而过度的负压处理会对材料造成较大的伤害,从而降低其成活率,如同时使用Tween20可以减轻这种伤害。此外,有人基于农杆菌转化机理结合基因枪法创建了(Agrolistic),将VirD1、“农杆枪法”VirD2基因连T2DNA上的。多胺也参与植物宿主和病原之间的相互作用。曾用多胺物质对农杆菌进行活化后侵染烟草做Kumar等19GUS瞬时表达研究,结果表明农杆菌的侵染活力显著提高。祖勇20利用多胺对携带植物表达载体pBI121的农杆菌EHA105进行活化之后侵染欧美杨107的

13、叶环。GUS瞬时表达分析表明多胺活化使农杆菌的侵染效率增强,腐胺和亚精胺处理分别为对照的2.4、1.8倍。经腐胺处理的EHA105侵染欧美杨107叶环所获得的GUS瞬时表达效果优于亚精胺。3接种方式的优化目的基因一同用基因枪打入植物细胞中,表达的VirD1、VirD2能在植物细胞内切割保守序列并一起转入细胞核。该方法集中了农杆菌转化方法中精确切割转移和低拷贝整合等特性以及基因枪法中无宿主范围限制的优点,因而是一种有发展前途的新思路。比较常用的接种方式是将外植体置于侵染液中浸泡,时38卷3期刘彩萍等优化农杆菌介导基因转化效率因子分析11434共培养中除菌方式优化及激素添加问题寻找各个作用因素的最

14、佳组合,使之都高效地发挥作用。这样不仅可以提高农杆菌转化能力,而且会节省时间和材料,起到事半功倍的效果。参考文献1王关林,方宏筠.植物基因工程M.2版.北京:科学出版社,2002.2韦大器.林木抗病基因工程进展J.亚热带植物科学,2005,34(3):74-77.3肖尊安.植物生物技术M.北京:化学工业出版社,2005.4FEUILLETC,LAUVERGEATV,DESWARTEC,etal.Tissue2andcell2epecificexpressionofacinnamylalcoholdehydrogenasepromoterintrans2genicpoplarplantsJ.Pl

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17、,等.国槐遗传转化体系的优化J.林业科学,2009,45(5):20-26.13郝贵霞,朱祯,朱之悌.毛白杨遗传转化系统优化的研究J.植物学报,1999,41(9):936-940.14杨秀荣,陈永文,方平,等.乙酰丁香酮对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响J.西南师范大学学报:自然科学版,2002,27(5):751-758.基因转化毛白杨的研究15刘斌,李红双,王其会,等.反义磷脂酶DJ.遗传,2002,24(1):40-44.16HIEIY,KOMARIT,KUBOT.TransformationofthericemediatedbyAgrobacteriumtumefaciensJ.P

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22、,2008,18(1):47-49.共培养是整个转化过程中非常重要的环节,因为农杆菌附着、T2DNA的转移及整合都在这一时期内完成。共培养时的有3个关键技术:共培养的时间、农杆菌的增殖适度和共培养中激素的影响。共培养的时间主要采用GUS染色来确定,表达率高、染色面积大为优。农杆菌的增殖适度直接与转化有关,如果农杆菌增殖生长不良,只有很少的农杆菌生长,则转化的几率很小,反之,农杆菌在外植体四周过度生长,可能引起外植体毒害,褐化死亡1。刘斌等15将农杆菌侵染后的叶片不经冲洗而直接转到预先用浓度5%蔗糖液浸湿的滤纸上过夜,既延长了农杆菌浸染时间又不致因叶片在菌液中浸泡时间过长而坏死,从而有更多的基因

23、转移机会。试验证明,转化频率有了明显提高。据对泡桐转化的经验,在滤纸上共培养的外植体转23次培养基就可完全抑制农杆菌,不加滤纸的即使多次转移也无法完全去除Jassen等3029。另外,在做猕猴桃叶片外植体共培养时也发现,加滤纸31显著优于不加滤纸,前者的GUS短暂表达率为10%,后者仅为2%16%。而冯勤等共培养时,固体培养基表面加1,等32,通过这种干燥处理后,又能有效抑制农杆菌的生长。共培养时培养基中是否加激素目前还没有定论,大多数人采用添加激素的方法。程家胜33认为共培养的培养基中34附加一定量的植物激素是非常必要的。刘庆忠等报道培35养基中附加生长素极大地提高转化率。而DeBondt等

24、则认为培养基中含有高浓度细胞分裂素比含高浓度的生长素对基因转移更有利,外植体在感染农杆菌后或由于抗生素的加入,细胞的生长受到影响,往往要调整培养基的成分促进外植体的再生。共培养时的光照视植物种类而异,有些植物需要光培养,有些需要暗培养。有研究显示连续光照能显著提高农杆菌转化植株的效率,但是具体机制还不清楚,可能是光照提高了寄主细胞对T2DNA复合物的接纳能力5褐变问题的优化处理36。在选择培养的后期,外植体褐变是比较常见的问题,同时也是诱导脱分化及再生芽的重大障碍。褐变主要与外植体受损、培养基水势及外植体转移时间有关。张妙霞等37在研究柿树的玻璃化现象中报道,培养基中琼脂粉含量由6g/L提高到

25、10g/L后,培养基的水势降低了0.030.04MPa,试管苗的水势降低了0.09MPa,减轻了褐变。在其他植物上,也有许多报道认为,保持温和的渗透胁迫,对植株再生有很大的影响,可能是因为高浓度的琼脂对愈伤组织产生了一种水分或营养胁迫,或者引起愈伤组织透气性的增加,从而减少愈伤组织的褐变38。农杆菌介导的植物遗传转化是一个复杂的生物过程,受多种因子共同作用。一些常规的基本转化因子确定后,并不能保证建立的农杆菌介导转基因体系是高效的,所以对遗传转化的主要因素进行优化是十分必要的。优化的过程就是(下转第1202页)1202安徽农业科学2009年白、游离脯氨酸含量及氮代谢相关酶进行了初步研究。结果表

26、明,随着水分胁迫程度的加深,桃树叶片可溶性蛋白含量降低,游离氨基酸含量增加,硝酸还原酶(NR)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)活性降低,谷氨酸脱氢酶(GDH)活性先升高后降低。参考文献1孙洪强,庞占荣,蒋春光.水分胁迫对果树形态和生理生化指标的影响J.北方果树,2008(1):1-3.2BRADFORDMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmi2crogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebindingJ.AnalyticalBiochemist

27、ry,1976,72:248-254.3张志良,瞿伟菁.植物生理学实验指导M.北京:高等教育出版社,2003:258-259.4陈薇,张德颐.植物组织中硝酸还原酶的提取、测定和纯化J.植物生理学通讯,1980,17(4):45-49.5黄维南,薛应龙.植物生理学实验手册M.上海:上海科学技术出版社,1985:219-223.6师素云,王学臣.羧甲基壳聚糖(NCMC)对玉米幼苗氮代谢有关酶活性的影响J.江苏农业学报,1997,13(2):70-72.7林清华,李常健,彭进,等.NaCl对水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脱氢酶的胁迫作用J.武汉植物学研究,2000,18(3):206-210.8王征宏,吕淑

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30、gy,2009,(104):128-131.18CHAIHM,ZHANGMM,CAIHJ.StudyonthesoilmoisturestresslevelinregulateddeficitirrigationexperimentJ.AgriculturalScience&Technology,2009,10(2):154-156硝酸还原酶(NR)是植物氮代谢中一个重要的调节酶和限速酶13。NR对水分胁迫非常敏感14。该试验结果表明,随着水分胁迫时间的延长桃树叶片NR活性逐渐降低,且NR活性下降幅度表现为:处理>处理。植物氮素吸收主要依靠GS/GOGAT循环。目前,谷氨酰胺合成

31、酶(GS)与谷氨酸合酶(GOGAT)构成的循环被认为是高等植物氨同化的主要途径+15。水分胁迫下GS活性的下降会造成植物叶片NH42N积累,该试验中桃树叶片GS活性和GOGAT活性均低于CK,且下降幅度表现为:处理>处理。GS和GOGAT活性的下降可能是水分胁迫下NR活性受到抑制,使得NO3还原、NH4同化受阻,导致生成了NH4及中间产物2酮戊二酸供应不足所致。谷氨酸脱氢酶(GDH)是一类广泛存在于植物、动物、微生物中的氧化还原酶,反应是:谷氨酸+NADP2酮戊+NH4。研究表明,+-+染条件下均会引起DH。,由于GS/GOGAT,GDH酶活性提高,GS活性降低,使NH4离子同化受阻,NH4发生积聚所致+16。但随着处理时间的延长,GDH活性呈下降趋势。目前,有关逆境影响植物氮代谢过程中关键酶活性的研究结果尚存在较大差异,但根据现有研