亚低温对局灶脑缺血再灌注后脑血流、血脑屏障、神经细胞损伤作用的研究

1、    亚低温对局灶脑缺血再灌注后脑血流、血脑屏障、神经细胞损伤作用的研究        【摘要】目的对比研究不同时期亚低温( MHT 32±0.2)对局灶脑缺血再灌注损伤的作用。方法64只雄性SD鼠被随机分成常温(NT)、缺血期亚低温(MHTi)、 再灌注期亚低温(MHTr)、缺血期加再灌注期亚低温(MHTi+r)四组，并用改良Koizumi's局灶 脑缺血模型，分别观察了动物缺血3小时再灌注3小时过程中，缺血周边和核心区局部脑血流 (rCBF)改变，再灌

2、注3小时后血脑屏障(BBB)破坏及再灌注72小时后缺血梗塞灶体积。结果MHTi+r及MHTi均有改善缺血周边区再灌注后急性高灌注和继 发低灌流及核心区持续低灌流、减轻血脑屏障破坏、减少缺血梗塞灶体积的作用。该作用 尤以MHTi+r为明显。MHTr作用有限。结论MHTi+r对皮层的保护作用较MHTi好。由此可推知，局灶脑缺 血再灌注损伤是个持续的过程，亚低温治疗不但要考虑开始时间，其持续时间对疗效具有同 样重要价值。【关键词】脑缺血再灌注损伤亚低温 The effect of mild hypothermia on cerebral blood flow blood-brain ba rrier

3、 and infarct volume after focal cerebral ischemia and reperfusion in r atsHUANG Fengping, ZHOU Liangfu.Dept. of Neurosurgery of HuaShan H os pital, SMU, Shanghai 200040【Abstract】ObjectiveTo compare the effects of mild hypothermia(MHT 32±0.2) induced in different time courses of cere bra l ische

4、mia and reperfusion. Methods64 male SD r a ts were divided into three mild hypothermic groups, which including intra-ische mi a(MHTi), intra-reperfusion(MHTr), intra-ischemia/reperfusion(MHTi+r) group, an d one normothermic group(NT 37±0.2) as control. Reversible focal ischemia wa s carried out

5、 in rats with modified Koizumi's model. Cortical blood flow was meas ured during 3hr of ischemia following 3hr of reperfusion. The permeability of bl ood-brain barrier(BBB) was estimated after 3hr of ischemia and 3hr of reperfusi o n. The infarct volume was measured at 72hr after reprefusion. Re

6、s ults The acute postischemic hyperperfusion and delayed hypoperfusion in ischemic perifocal region and sustained hypoperfusion in ischemic core were inhi bit ed in both MHTi+r and MHTi groups. The disruption of BBB and the infarct volume in the basal ganglia and cortex regions were significantly le

7、ss in both MHTi+r a nd MHTi groups, especially in the MHTi+r group. The effect of MHTr on prolonged ischemia/reperfusion injury was limited. ConclusionThis study demonstrated that MHTi+r has more substantial protective effects on reduc ing ischemia/reperfusion injury than MHTi. These differences bet

8、ween MHTi and MH Ti+r suggest that ischemic and reperfusional injury is an ongoing process, and t he concept of MHT therapeutic window must include not only the time of initiating but also the duration of the intervention.【Key words】Focal cerebral ischemiaReperfusion injury Mild hypothermia脑缺血后再灌注的作

9、用已被广泛研究。短期缺血后再灌注有减轻缺血损伤的 作用，长时间的缺血后再灌注可导致急性高灌注和(或)继发持续低灌流、加剧血脑屏障破坏 和脑水肿、加重脑缺血损伤1。近期研究表明，缺血期亚低温有抑制缺血后过度 灌注、减轻神经细胞损伤的作用2。但是，采取缺血期持续至再灌注期的亚低温 对缺血再灌注后脑血流改变、血脑屏障破坏及神经细胞损伤的影响却未见报道。本研究用SD鼠改良Koizumi's3局灶脑缺血模型，通过测量局部脑血流(CBF)、血 脑屏障(BBB)及梗塞灶体积，对比研究缺血期(MHTi), 再灌注期(MHTr) 及缺血期加再灌注期 (MHTir)亚低温(mild hypothermia

10、 MHT32)对局灶脑缺血再灌注损伤的作用。材料和方法1.动物准备：雄性SD鼠，体重280310g。实验时动物行气管插管，呼吸机(rod ent ventilator model 683. Harvard USA)吸入0.5%1%异氟醚与70%N2O、30%O2的 混 合气体维持麻醉。PE50管行右侧股动脉插管，以连续监测血压，并于缺血前5分钟、缺血后9 0分钟、再灌注后90分钟抽血，做血气、血糖测定，以利调整呼吸机。测体温探头经肛门插 入，并与自动控温仪相连(MTA-4702，Meditherm Gaymar Inc. USA)以控制体温在32或37 。2.动物模型：实验采用改良Koizum

11、i's大鼠大脑中动脉(MCA)局灶缺血模型3。 缺血时间为3小时，再灌注时间为3小时或72小时。3.脑温的测定和维持：脑温用硬膜外温(EDT)间接反映。切开右侧头皮，于前囱右旁3mm前1 mm处钻孔，于硬膜外内扳下间隙插入26G测温探头(E-type Omega Engineering Inc. USA) 并与测温仪(450 AET Omega)连接。EDT维持在37者为常温组，32者为亚低温组。脑温的 升降及维持，采用60W白炽灯加热、冰袋降温、调节自动控温仪来完成。4.实验动物分组：实验分常温组(NT)、缺血期亚低温组(MHTi)、再灌注期亚低温组(MHTr) 、缺血期持续至再灌注

12、期亚低温组(MHTir)四组，每组动物16只。其中8只大鼠缺血3小时 再灌注3小时后处死行BBB破坏体积测定，另8只缺血3小时再灌注3小时过程中行CBF测定，再 灌注72小时后动物处死，行梗塞灶测定。5.梗塞灶测定：动物麻醉断头取脑，冠状切片层厚2mm，2%TTC磷酸缓冲液(pH7.4)37恒 温染色30分钟，4%Formalin缓冲液(DBpH7.4)固定30分钟后拍照留用。梗塞灶体积计算用电 脑完成(Medical Image Processing System， FG-100 Series. Imaging Technoloyg Inc. USA)。6.局部脑血流量测定：用激光多普勒血流

13、测定仪(LDF：Multichannel Laser Doppler Syst em, Perimed Sweden)，分别测定实验侧前囱后1mm，旁开5mm和1mm两点(该两点分别代表本 实验模型缺血灶的核心区及周边区4)脑皮层表面血流。以缺血前CBF为基值，缺 血期、再灌注期各点CBF值为基值的百分比。7.BBB测定：本实验组动物，在实验结束前3小时，经静脉注入3%Evan's蓝Krebs平衡液0.5 ml，实验结束时，加深动物麻醉，先用100ml肝素盐水(肝素100mg/L)心内灌注冲洗，再用4% 多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)灌注固定20分钟，取脑冠状切片，层厚2mm，拍照留

14、用。BBB破 坏程度以Even's蓝渗漏出血管壁而着色的脑组织体积表示，具体计算方法同梗塞灶体积测定 。8.统计学处理：各组间CBF值比较，用配对资料t检验；各组间BBB和值比较，用非配 对资料t检验。各数值均用mean±SD表示，P0.05示差别显著。结果1.亚低温对生理指标影响：在整个实验过程中各生理指标包括血压、血气、血 糖均控制在正常范围内。虽然各组实验动物缺血开始后平均动脉压均有不同程度下降，但下 降后的平均动脉压值仍维持在正常生理范围内，各实验组间，生理指标统计无差异。2.亚低温对脑血流的影响：缺血开始后，各实验动物CBF值均迅速下降，20分钟后趋于稳定 。其中缺

15、血周边区平均下降至缺血前的12%30%，核心区降至8%15%，各实验组缺血周边 和核心区CBF值无显著差异。再灌流后，在缺血周边区，MHTr和NT组可见明显的急性高灌注 和继发低灌流；MHTi+r组维持在87%103%之间；MHTi组再灌注早期CBF变化与MHTi+r组相似 ，再灌注2小时后CBF明显下降，与MHTi+r组比P0.05。在缺血核心区，MHTr和NT组再 灌注后则表现为持续低灌流。尤其是NT组，再灌注后CBF值尚不到缺血前的30%；MHTi组再 灌注1小后CBF下降至61%±16%，与对照组相比P0.05，与MHTi+r组比无显著差异。3.亚低温对血脑屏障的影响：4个实

16、验组共8只假手术动物中，除1只因钻孔放置硬膜外测温 探头时，误伤皮层造成该皮层区点状Even's blue浓染外，余7只动物脑组织均无染色，因此 ，亚低温并不影响正常BBB的通透性。但各实验组间，BBB通透性差异明显(1)。1各组动物血脑屏障破坏及分布情况*P0.05 vs NT,P0.05 vs MHTra P0.05 vs MHTi4.亚低温对缺血梗塞灶的影响：实验72小时内，MHTi+r组和MHTi组无一例动物死亡，MHTr 组死 亡1例，NT组死亡2例。尸体解剖示3例均死于脑肿胀。且MHTi+r和MHTi组梗塞灶体积明显较N T和MHTr组小(2)。2各组动物72小时后皮层，基

17、底节及总的缺血梗塞灶体积*P0.01 vs NT, P0.05 vs MHTr a P0.05 vs MHTi讨论本实验证实，MHTi和MHTi+r有减轻局灶脑缺血再灌注后神经元损伤、BBB破坏、C BF紊乱的作用，MHTi对局灶脑缺血再灌注损伤的保护作用，在不同的缺血模型中均得到证 实 2，5。MHTi+r的作用却未见报道。从临床角度看，降温麻醉(如脑、心脏等手 术)经常形成于手术开始之前，并维持到手术结束，复温是个缓慢、渐进过程；颅脑外伤病 人亚低温治疗初步结果提示，持续24小时以上的亚低温治疗效果明显，且不增加出凝血障碍 、脑内出血、感染等并发症6。因此，MHTi+r作用的研究，对临床上

18、开展亚低温 治疗具有重要意义。本实验第一次对比研究MHTi和MHTi+r的作用，发现MHTi+r具有明显地 减轻 脑缺血损伤作用，且其作用较MHTi更显著，尤其是对皮层损伤的保护作用。从本实验结果看 ，单纯的MHTr对梗塞灶大小并无明显的保护作用，这与Xue等5实验结果相反 。结果不同原因，可能与梗塞灶计算时间不同有关。研究证明脑缺血再灌注损伤是慢性、进 行性的，低温可延缓脑梗塞发生，一般到实验后72小时，脑梗塞才定型7。Xue 等 在实验6小时后即计算梗塞灶体积，显然较实际小，不能真实反映脑缺血再灌注损伤程度及 亚低温的作用。局部脑血流的改变，是脑缺血和再灌注损伤的根本原因。局部脑组织血供的

19、下降，使该部分 脑组织能量代谢障碍，各种能量依赖型的离子通道功能 失调，进而引发多种神经递质的大 量释放、调节酶失衡、自由基生成、细胞膜破坏、蛋白质合成障碍，最终导致神经细胞的急 性或慢性死亡8。缺血后再灌注早期的急性高灌注，会加剧血脑屏障破坏和脑水 肿，是再灌注后继发性脑损伤的重要因素4。再灌注后持续低灌流对脑缺血再灌 注损伤的直接作用目前尚不明确，但干扰药物实验表明，抑制持续低灌流能明显减小脑缺血 梗塞灶体积9。因此改善缺血脑组织血供，抑制再灌注后急性高灌注和持续低灌 流，是预防治疗脑缺血再灌注损伤的关键。本实验结果证实，MHTi和MHTi+r，尤其是后者， 明显具有抑制再灌注后的急性高灌

20、注和继发低灌流，改善持续低灌流的作用。血脑屏障破坏是血管内血清蛋白，水分及各种有害物质外渗，继发血管性脑水肿和脑实质损 伤的基础10。Dietrich等11用全脑暂时性缺血模型证实，MHTi(3 033)能有效降低缺血再灌注后血脑屏障对辣根过氧化酶的通透性。本实验用局灶脑缺 血模型也得出了同样结论。同时还发现，MHTi+r对血脑屏障，尤其是皮层血脑屏障的保护作 用较MHTi更明显(1)。研究证实，血脑屏障通透性的增加与各种原因引起的缺血后高灌注 有关，阻止高灌注的发生，就能明显抑制血脑屏障的破坏和血管源性脑水肿的发生，减轻继 发性脑损伤。结合前面的结果，本实验的第一个结论也证实了这一点。但单用

21、这一机制很难 解释本实验第二个结论即MHTi+r对血脑屏障保护作用较MHTi更强。从本实验看，MHTi+r组和 MHTi组动物除缺血周边区再灌注2小时后局部血流存在差异外，并无其它明显差别。由此可 推知，血脑屏障破坏程度，与继发低灌流也有密切联系。作者单位：200040上海医科大学华山医院神经外科参考文献1Memezawa H, Smith ML, Siesjo BK. Penumbral tissues salvaged b y reperfusion following middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1992, 23:5

22、52-559.2Goto Y, Kassell NF, Hiramatsu K, et al. Effects of intraischemic hypot hermia on cerebral damage in a model of reversible focal ischemia. Neurosurgery, 1993, 32:980-984.3Longa EZ, Weinstein PR, Carison S, et al. Reversible middle cerebral a rtery occlusion without craniectomy in rats. Stroke

23、, 1989, 20:84-91.4Yang GY, Betz AL. Reperfusion-induced injury to the blood-brain barr ie r after middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1994, 25:1658-1665. ZK)5Xue D, Huang ZG, Smith KE, et al. Immediate or delayed mild hypothermi a prevents focal cerebral infarction. Brain Res, 1992, 587:66-72.6Marion DW, Obrist WD, Carlier PM, et al. The use of moderate therapeut ic hypothermia for patients with severe head injuries: a preliminary report. J N eurosurg, 1993, 79:354-362.7Gehrmann J, Bonnekoh P, Miyazawa T, et al. The microglial reaction in the rat