Cathepsin B、uPA和uPAR基因在肝细胞肝癌中的表达、相互关系及作用

1、Cathepsin B、uPA和uPAR基因在肝细胞肝癌中的表达、相互关系及作用     【摘要】  目的: 探讨肝细胞肝癌（HCC）组织中组织蛋白酶B(CB)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体（uPAR）基因的表达、相互关系及作用，并分析其机制。方法: 应用RT-PCR方法测定71例肝组织标本，包括对照组（C）12例，HCC组34例和癌旁组织（PTT）组25例的CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA表达，分析其间的相关性。结果: HCC组CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA表达均明显高于C组和PTT组，差

2、异有显著性（P <0.01），PTT组与C组间差异均无显著性（P >0.05）。CB mRNA与uPA mRNA（r0.805），CB mRNA与uPAR mRNA（r0.786），uPA mRNA与uPAR mRNA（r0.874）之间均存在显著的正相关关系（均P <0.01）。结论: 肝癌组织CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA均呈现高表达，它们之间可能相互诱导，协同促使肝癌的侵袭和转移。 【关键词】  癌 肝细胞 组织蛋白酶B 尿纤溶酶原激活物 尿纤溶酶原激活物受体   Expression，relationship and

3、 effect of gene of cathepsin B，urokinase-type plasminogen activator（uPA）and its receptor（uPAR）in hepatocellular carcinoma  XU Chang-long*，ZHENG Jun-jie，XUE Zhan-xiong，HUANG Zhi-ming*Department of Digestive Medicine，the Second Affilated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325027 

4、60;  Abstract:  Objective: To determine the expression, relationship and function of gene of cathepsin B (CB)，urokinase-type plasminogen activator（uPA）and its receptor（uPAR）in hepatocellular carcinoma，and to explore their effects and mechanism. Methods: The expression of CB mRNA，uPA mRNA a

5、nd uPAR mRNA in 71 specimens of human hepatic tissue，including control (C) 12，hepatocellular carcinoma (HCC) 34 and paratumor tissue of hepatocellular carcinoma (PTT) 25 were detected with reverse transcription-polymerase chain raction (RT-PCR). The expression of relationship among CB mRNA,uPA mRNA

6、and uPAR mRNA were researched. Results: The CB mRNA,uPA mRNA and uPAR mRNA in HCC were very significantly higher than those in C and in PTT（all P <0.01）；there had no significant difference between PTT and C (all P >0.05).There were significant correlation between the expression of CB mRNA and

7、uPA mRNA（r0.805），CB mRNA and uPAR mRNA（r0.786），uPA mRNA and uPAR mRNA（r0.874）（all P <0.01）. Conclusion: The CB mRNA，uPA mRNA and uPAR mRNA show strongly expression in HCC and they may induce each other, promote cooperatively invasion and metastasis of HCC.    Key words:  

8、 hepatocellular carcinoma；cathepsin B；uPA; uPAR；neoplasm invasiveness；neoplasm metastasis    基底膜和细胞外基质是肿瘤细胞侵袭的第一道屏障。目前研究发现，组织蛋白酶B(Cathepsin B，CB)对基底膜和细胞外基质的降解是恶性肿瘤侵袭转移的关键步骤之一1,2，尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）与其受体（urokinase-type plasminogen activator receptor，uPA

9、R）构成的uPA/uPAR系统介导的纤溶酶系统可能在其中发挥核心作用3，而它们在肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）演进过程中的变化特点、相互关系鲜见报道。本研究应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测肝细胞肝癌组织中CB、uPA和uPAR基因表达，分析其间的相关性，探讨它们在HCC侵袭转移中的作用和机制。    1  材料和方法    1.1  试剂与仪器  CB、uPA、uPAR、-action基因引物序列采用Primer Premier 5.0自行设计，由北

10、京赛百盛基因技术有限公司代为合成，并用高效液相色谱法（HPLC）确认合成产物的纯度。Trizol总RNA提取试剂盒（Life Technologies公司生产）。PE2400 PCR扩增仪（Perkin璄mer公司生产）。    1.2  标本采集及分组  取自2002-2004年温州医学院第一、第二附属医院手术切除的肝组织。 所有标本离体30 min内经0.1% DEPC清洗后装入冻存管，置-140 oC液氮储存箱保存待用。分为：对照组（control，C组）12例（肝外伤手术标本，病理证实为正常肝组织）。肝细胞肝癌癌旁组织组（paratum

11、or tissue of hepatocellular carcinoma，PTT组）25例（临床诊断为肝癌，根治性手术切除的癌旁组织，距肝癌原发灶5 cm以上，病理确认为晚期肝硬化）。HCC组34例（临床诊断为肝癌，根治性手术切除的标本，病理确认为HCC）。    1.3  逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CB、uPA、uPAR基因  取50 mg标本组织，制成匀浆，冰浴下加入Trizl提取总RNA；采用M-MuLV按标准程序进行逆转录；续PCR扩增。基因引物序列为： CB mRNA: 正链 5瑼CA GCC CGA CCT ACA

12、AAC AG?,负链 5瑿CA GTA GGG TGT GCC ATT CT?,产物为239 bp。 uPA mRNA：正链 5瑼TC AGC TTC ACA ACA GTC AT?，负链 5瑼GA ATT CAC CAC CAT CGA GA?，产物为474 bp。 uPAR mRNA：正链 5瑿AG ACT TGC TGT GTG ACC TCA?，负链 5瑼AT AAC AAC AAC ACA ACA GCG G?，产物为184 bp。-action：正链 5瑿AG CTA CAG CTT CAC CAC CA?，负链 5璆TC ACC TTC ACC GTT CCA GT?，产物为69

13、6 bp。电泳结束后取出凝胶，用Image master VDS成像系统摄影，图像分析软件(Total lab V101)行灰度扫描分析。以目的基因与-actin的PCR产物条带灰度值之比作为其mRNA水平的相对量。RT-PCR 反应体系中未加入逆转录酶的作为空白对照。    1.4  统计学处理方法  采用SPSS13.0软件完成。多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析，方差齐性者用LSD法，方差不齐者行Games-Howell法。    2  结果    2.1  三组CB mRNA、 uPA mRNA和uPAR mRNA的表达情况  RT-PCR实验显示，HCC组CB mRNA、uPA mRNA和uPAR mRNA的产物条带亮度明显高于PPT组和C组，PPT组与C组的条带亮度差异不大（见图1、2、3）；HCC组CB mRNA、uPA mRNA和uPAR mRNA的条带光密度比值均高于C组和PTT组，差异有显著性（均P <0.01）。PTT组与C组比较三指标差异均无显著性（均P >0.05），见表1。