乌司他丁对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的保护作用

1、乌司他丁对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的保护作用        【摘要】     目的 评价乌司他丁对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的保护作用。 方法 将受体分为三组：(1)对照组A：两人同时操作，将刚离体的供肠立即植入受体，使移植肠的冷缺血时间为0；(2)对照组B；(3)UTI B组。后两者按照正常的单人操作，供肠的冷缺血时间平均为1h，第1组的术后处理同第2组，即不使用任何药物干预。分别于刚离体时、术后4、24h切取供肠3cm，测定其中丙二酰二醛（malondiald

2、ehyde, MDA）的含量。 结果 与各自的基础含量相比，三组供肠组织中的MDA含量在供肠血运恢复后的第4、24h均明显地升高并维持在一个较高的水平（P<0.05）。与其他两组相比较，对照组B升高最显著（P<0.05），而UTI B组则在上述2个时点的MDA含量与对照组相似（P>0.05）。 结论 酶抑制剂UTI能抵抗缺血再灌注时氧自由基（oxygen free radiacls，OFRs）所致的损伤而具有保护作用，从而促进移植肠结构和功能的恢复。     【关键词】  乌司他丁 缺血再灌注 损伤 大鼠小肠移植 &

3、#160;  基金项目：浙江省卫生厅基金资助项目(2002B38)【Abstract】 Objective  To evaluate the protective effects of Ulinastatin (UTI) against ischemia-reperfusion injury of the graft in rat small bowel transplantation(SBT). Methods  We divided recipients into 3 groups in random:1. control group (0),the

4、 group of zero-cold-ischemia models were made that the grafts were transplanted as soon as they were removed from the donor rats under the collaboration of two operators. 2. control group (1), 3.UTI group (1). These former two groups were not interfered with any drug after SBT. Then regarded the con

5、trol group (1) and the UTI group (1) of the former experiment as another 2 groups. Because the cold-ischemia-time of the grafts in these 2 groups were meanly 1h under one operator manipulating in ordinary. 3cm length of distal small bowel was acquired from each graft as soon as it was removed from t

6、he donor, measuring MDA content as base content (control). Then same length of graft was harvested from each recipient at 4 and 24h after revascularization respectively. All MDA contents were measured by commercial kits.  Results  All MDA contents of 3 groups obviously increased and mainta

7、ined a high level than their base contents (P<0.05) during the early post-revascularization period (within first 24h). Among three groups, control（1）group showed the highest elevation, and its MDA content was greatly higher than that of the other groups （P<0.05）. and the MDA content of UTI gro

8、up (1) was the same as that of control group (0) at 4h and 24h respectively after revascularization (P>0.05). Conclusions  It is supposed that UTI demonstrates protective effects against ischemia-reperfusion injury of OFRs (oxygen free radicals) in rat SBT, and helps to the structural and fu

9、nctional recovery of the transplanted small bowl.【key words】  Ulinastatin  Ischemia-reperfusion  Injury  Rat small bowel transplantation   小肠黏膜是迄今发现的对移植物缺血再灌注损伤最敏感的脏器之一，移植肠的损伤将会导致移植肠功能不良或丧失、细菌易位及受体系统性感染，这些都将直接影响手术的成败，其主要原因在于缺血再灌注损伤中被激活的多形核白细胞（polymorphonuclear leuk

10、ocytes，PMN）所产生的各种蛋白酶、氧自由基（oxygen free radicals，OFRs），以及被非特异性炎症反应所放大的各种炎症介质、细胞因子和OFRs对组织结构的破坏起着非常重要的作用，乌司他丁（UTI）作为一种新型酶抑制剂可抑制多种蛋白酶，还可以稳定溶酶体膜、清除氧自由基、抑制炎性介质的释放。本实验旨在通过移植前后供肠组织中脂类OFRs过氧化作用产物丙二酰二醛（malondialdehyde，MDA）含量的检测，探讨蛋白酶抑制剂UTI在大鼠小肠移植中对移植肠缺血再灌注损伤的影响。1  材料与方法1.1  材料 供体封闭群雌性SD大鼠及受体雄性W

11、istar大鼠各32只(供、受体各32只),由温州医学院动物实验中心提供，体重200300g。MDA试剂盒购自南京××工程研究所。注射用UTI由广东××公司提供。8-0无损伤缝线购自浙江眼科，显微手术器械购自上海；一次性静脉留置针管（型号16GA 5.25IN  1.7×133mm）若干。1.2  方法 供、受体术前分别置代谢笼中禁食12h，自由饮水，2025下清洁手术，整个过程均在肉眼下单人操作。20%乌来糖5ml/kg腹腔注射麻醉。(1)大鼠小肠移植模型的建立和分组：采用自行改良的一种简化的大鼠异位节段小肠移植

12、技术建立大鼠小肠移植模型。22只大鼠存活12只，随机分为对照组B和UTI B组，供肠的冷缺血时间平均为1h。(2)冷缺血时间为0的移植模型的建立：两人同时操作，使供肠能在一离体时即进行移植手术，从而使之冷缺血时间为0。10只术后存活6只，因冷缺血时间为0，亦未使用任何药物干扰，为对照组A，其余步骤同其他组。(3)肠标本的获取：每只在供肠刚离体时切取长3cm的远段小肠，测定MDA的基础含量；每只分别于供肠血运恢复后的第4、24h切取长3cm的远端供肠。(4)标本处理及MDA测定：供肠标本取下后，立即放入特制的磷酸缓冲液中（04）洗去血液，用组织匀浆机制成匀浆液，再用超声波将细胞击碎，以试剂盒直接

13、测定MDA含量。1.3  统计学处理 以均数±标准差（x±s）表示，组间差异行t检验。2  结果    与各自的基础含量相比，各组供肠组织中的MDA含量在供肠血运恢复后的第4、24h均明显地升高并维持在一个较高的水平（与各自的基础含量相比，P<0.05）。其中，对照组B升高最显著，而使用了UTI治疗的UTI B组，则可抵抗这种损伤，其在上述2个时点的MDA含量与对照组A相似（P>0.05）。见表1和图1。表1  移植肠中MDA的含量（略）3  讨 论   

14、; 在以往的实质性脏器移植中，人们已经认识到缺血再灌注损伤的重要性，因为缺血再灌注损伤直接关系着移植物术后功能的恢复，一直以来科研工作者及临床医务人员不断地为寻找减轻这种损伤的有效途径而努力。由于小肠特殊的组成和结构，使得小肠黏膜成为目前已知的对缺血再灌注最为敏感的组织之一。在小肠移植过程中，缺血再灌注损伤与术后出现的并发症如肠功能不良或功能恢复缓慢、肠细菌易位、及系统性的感染直接相关，可导致受体死亡。故减轻缺血再灌注损伤对于成功的SBT来说是至关重要的。    移植器官冷保存再灌注损伤的程度主要与冷缺血的时间有关而不是取决于再灌注本身。大鼠小肠即使冷缺血1h，小

15、肠黏膜即可出现形态学的改变，并随着缺血时间的延长而加重，当缺血时间达到12h时，损伤便可累及黏膜下层。动物实验显示，大鼠脑细胞一旦缺血，即产生OFRs，脑组织中MDA含量随即升高。低温虽然降低了器官代谢水平，但代谢并未完全停止，而氧供已完全中断，使冷保存过程中移植器官发生缓慢而渐进性的损伤，损伤的程度根据器官对冷缺血的耐受而不同。缺血过程中产生的OFRs造成对肾脏的损伤可直接导致大鼠死亡；在心脏可至心肌纤维的凝固性坏死和纤维化。    许多研究发现，在缺血再灌注时，小肠组织中出现大量的OFRs，造成对组织的损伤，故实验和临床都将组织中OFRs作用后的中间产物MDA

16、的含量作为评价组织产生OFRs水平或由OFRs引起的组织损害严重程度的指标，MDA含量越高表示损害越重。本实验中，三组移植肠标本中MDA的含量在血运恢复后的早期（24h内）阶段，均明显地升高，并维持在一个较高的水平。其中以对照组B的升高最为显著，它在血运恢复后的第4、24h，MDA的含量又显著地高于其余两组（P0.05）。三组中以对照组A移植肠缺血的时间最短（仅为在血供恢复前的热缺血），无冷缺血阶段，但其损伤亦不可避免。由此可见，只要存在缺血再灌注这一过程，损伤将必然发生，而损伤的程度则与缺血的时间成正比。实验数据显示，同样在4、24h，对照组A和UTI B组之间，差异则不显著（P>0.05），提示UTI可减轻这种损伤。    由于MDA是移植肠组织中脂类过氧化作用后的产物，故MDA的含量可间接地反映供肠组织在缺血再灌注损伤过程中所产生的OFRs的含量。OFRs主要由被激活的多形核白细胞（PMN）释放，可造成细胞膜性结构中脂类过氧化，使细胞膜、溶酶体膜通透性发生改变，导致细胞肿胀破裂，溶酶体酶释放，直至细胞死亡。UTI作为多种蛋白酶抑制剂，虽然尚未