不同糖尿病模型小鼠糖原代谢变化的研究

1、不同糖尿病模型小鼠糖原代谢变化的研究研究原着?6l3?中【临末药理学与治疗学中国药理学会主办2005Jun;10(6):613616不同糖尿病模型小鼠糖原代谢变化的研究肖梅芳,张学梅,白香,谭焕然北京大学医学部基础医学院药理学系,北京100083;大连大学医学院基础医学部药理教研室,大连116622,辽宁摘要目的:通过观察不同类型糖尿病动物模型糖原代谢的变化,初步探讨糖原代谢异常在糖尿病发病过程中的作用方法:首先建立4种糖尿病小鼠模型:四氧嘧啶诱导模型,STZ诱导模型,n5一STZ诱导模型和葡萄糖激酶基因敲除模型,并对模型小鼠和肌糖原的含量,并采用Westernblot方法对葡萄糖激酶基因敲除

2、模型鼠肝组织中葡萄糖激酶的蛋白表达量进行测定.结果:血糖检测结果显示各模型组空腹血糖值均显着高于对照组,表明糖尿病造模基本成功:除n5一STZ诱导模型外,其它模型组肝糖原的含量均明显低于对照组.此外,与对照组比较,4结果表明葡萄糖激酶基因敲除模型鼠肝组织中葡萄糖激酶的蛋白表达显着降低,这可能是该模型肝糖原含量减少的机制之一.结论:糖尿病动物模型出现糖原代谢异常.表现为肝糖原和肌糖原减少,提示糖原代谢在糖尿病发病过程中起着重要的作用.关键词糖原;动物疾病模型;四氧嘧啶;链脲佐菌素;糖尿病;葡萄糖激酶文献标识码:A文章编号:10092501(2005)06061304糖原代谢是体内糖代谢的重要组成

3、部分,体内体内血糖的重要来源,当机体需要葡萄糖或者血糖080803和2【x】2AA2l42O1)肖梅芳.女.硕士,研究方向:分子药理学谭焕然.通讯作者,女,教授,研究方向:分子药理学Tel:010.82802O04E.mail:,O11水平降低时,它可以迅速被动员分解入血以补充血糖6一磷酸酶,故肌糖原不能分解为葡萄糖来补充血糖,它主要为肌肉收缩提供能量糖原代谢的紊乱可能会引起血中葡萄糖浓度升高,进而导致糖尿病象,包括经典的1型糖尿病模型四氧嘧啶诱导模型和链脲佐菌素(streptozotoein,STZ)诱导模型,以及2型糖尿病模型链脲佐菌素诱导的2型糖尿病模

4、型(n5一STZ诱导模型)和由本室构建的肝脏特异性葡萄糖激酶基因敲除模型,观察糖尿病动物模型糖原代谢的改变,对糖原代谢在糖尿病发病过程中的作用进行初步探讨,以期为糖尿病的临床防治提供实验依据:1材料与方法1.1动物与试剂雄性昆明小鼠,C57BL/6J小鼠和ICR小鼠,SPF(specialpathogenfree)级,体重1822g,购自北京大学医学部实验动物中心,动物合格证号:SCXK(京)20020001四氧嘧啶购自Fluka公司(美国);链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司(美国);罗氏血糖仪购自罗氏诊断产品(德国);兔来源的葡萄糖激酶多克隆抗体购自Santacz公司(美国);碱磷酶标

5、记羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术;葡萄糖试剂盒(氧化酶法)购自北京北化康泰临床试剂;肝糖原测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;NBT/BCIP染色试剂盒购自华美生物工程公司;其余试剂均为国产分析纯.导模型的制备:昆明小鼠,68周,禁食12h后,以100mg?kg一次性尾静脉注射四氧嘧啶生理盐水.?614?高水平者作为糖尿病模型;STZ诱导模型的制备:C57BL/6J小鼠,68周,禁食12h后,一次性腹腔注射STZ100mg?kg体重(0.1tool?L柠檬酸钠稀释,1)H4.5),1周后空腹血糖高于16.7nmlol?L作为糖尿病模型鼠.注射生理盐水作为对照组:型的建立:取5d龄ICR

6、小鼠,腹腔注射STZ100mg?kg.体重(0.1mol?L柠檬酸钠稀释,pH4.5),5d后再补注STZ60mg?kg体重小鼠断乳后,给予正常饲料喂养4周后剪鼠尾采血,用罗氏血糖仪测血糖:腹腔注射等量生理盐水作为对照组;基因敲除糖尿病模型的建立:本研究室已经成功构建了一种新的2型糖尿病动物模型肝脏特异性葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因敲除小鼠模型,该模型的建立基于CreloxP条件性基因打靶技术:首先将两个同方向的loxP序列插入到目的基因GK外发生正确同源重组的ES细胞显微注射入小鼠囊胚,移植入假孕雌鼠,获得Fl代嵌和体小鼠:嵌和体小鼠进一步杂交后得到条件打靶小鼠:将该打靶小

7、鼠与肝脏特异性表达Cre重组酶(AlbCre)的转基因昆明小鼠杂交,得到肝脏特异性葡萄糖激酶基因敲除小鼠:以正常昆明小鼠作为对照组:1.4血糖测定小鼠禁食8h以上(不禁水),眼球后静脉丛取血,3000r?min离心8min分离血清.参照试剂盒说明书,用葡萄糖氧化酶法测定血清中糖仪:鼠肝组织及肌肉组织中糖原的含量?糖原含量的测定采用蒽酮法.动物脱颈椎处死,取小鼠肝组织及股四头肌,用生理盐水漂洗后滤纸吸干,称重,采用糖原测定试剂盒检测肝/肌糖原的含量葡萄糖激酶的表达小鼠脱颈椎处死,迅速取出肝脏置于液氮中,一70cc保存待用:取一小块肝组织(200rag)加入500址l预冷的三去污裂解缓冲液(50I

8、Tu11o1.LTris,150mmol?LNaC1,0.02%叠氮钠,0.1%SDS,l%NP.40,0.5%去氧胆酸钠,1mmol?L一'EDTA,100mg?L一PMSF,1mg?L一Leupeptin,pH8.0),于冰上迅速匀浆,经4cc10000×g离心10rain后,吸取上清,反复离心3遍,吸取清亮度:约取100g蛋白液加入等体积的2XLSB凝胶ChinJClinPhamlacolTher2005Jun;10(6)加样缓冲液(100mmol?ITris,4%SDS,0.2%溴酚兰,20%甘油,200mmol?LDTF,pH6.8),置于沸水浴中煮沸变性:经SDS

9、聚丙烯酰胺凝胶电泳后,电转移至硝酸纤维素滤膜,随后用5%(w/v)脱脂奶室温封闭12h:一抗4cc孵育过夜后TBST漂洗滤2000成像仪拍照并扫描光密度值半定量比较.1.7统计学处理实验数据以均数-4-标准差(-4-较采用独立样本t检验,各组之间显着性比较采用单因素方差分析(onewayANOVA).2结果2.1糖尿病模型小鼠血糖的测定与对照组相比,糖尿病模型组空腹血糖值多介于1015mmol?L之间;1型糖尿病模型组血糖升高更为明显,空腹血糖值高达30rrlol?L(图1):模型组与各自的对照组比较均具有显着性差异;此外1型糖尿病模型组与2型糖尿病模型组相比较也具有显着性差异,表明造模基本成

10、功,可以用于以后的实验.二0吕目罄鲁篷ABCD图1糖尿病小鼠模型的空腹血糖浓度(.4-S,n=5)与各自对照组比较"P<0.05;与四氧嘧啶诱导模型组比较P<0.05;与STZ诱导模型组比较P<0.05;A:四氧嘧啶诱导模型;B:STZ诱导模型;C:n5一STZ诱导模型;D:GK基因敲除模型照组比较,四氧嘧啶诱导模型组和STZ诱导模型组糖原的含量降低了约60%,STZ诱导模型组降低了对照组比较,四氧嘧啶诱导模型组和STZ诱导模型组分别减少了55%和26%(表1).中国临床药理学与治疗学2005Jun;10(6)表11型糖尿病动物模型肝糖原和肌

11、糖原含量测定(i-i-S,n:5)?615?检测结果显示n5一STZ诱导模型肝糖原含量与对照组相比有减少的趋势,但是尚无统计学意义肝脏特异性GK基因敲除模型的肝糖原含量则明显低于对照组,与对照组相比减少了约90%.2个模型组比较,n5一STZ诱导模型和GK基因敲除模型肌糖原含量分别减少了67%和60%(表2).表22型糖尿病动物模型肝糖原和肌糖原含量测定(±S,n=5)达用Westernblot方法检测肝脏特异性GK基因敲除模型小鼠肝组织中葡萄糖激酶的蛋白表达量.GK基因敲除鼠肝组织中葡萄糖激酶的含量明显减少(图2),较对照组减少了约35%,这可能是该模型肝糖原含量减少的机制之一.?

12、皿鞠星溢鞲糖耀GK对照组K/O图2GK基因敲除模型小鼠肝组织中葡萄糖激酶的蛋白表达情况(-i-S,n=5)3讨论疾病动物模型是研究人类疾病发病机制的重要工具.为了研究糖尿病糖原代谢的变化,我们分别构建了1型糖尿病小鼠模型和2型糖尿病小鼠模型,包括四氧嘧啶诱导模型,STZ诱导模型,n5一STZ果表明上述4种动物模型血糖水平均明显高于正常值,且1型糖尿病模型的血糖浓度远远高于2型糖尿病模型,约为2型的23倍,与临床上1型和2型糖尿病患者的血糖水平相吻合,提示我们成功制备了上述糖尿病动物模型:肌糖原合成减少或者肝糖原分解增加可以引起血糖水平的升高,导致糖尿病的发生;反之,某些促进糖出2型糖尿病患者肌

13、糖原含量明显低于正常人群.此外,Bischof和krssak等人发现糖尿病患者们的实验结果可以得出:不管是l型糖尿病模型,还是2型糖尿病模型,均出现不同程度的肝糖原和肌论是肝糖原还是肌糖原代谢,对糖尿病的发病都起着重要的作用;同时也表明糖原代谢异常在1型糖尿病和2型糖尿病的发病过程中都扮演着重要的角色.葡萄糖激酶是肝糖原合成途径中的限速酶,对肝糖原代谢起着至关重要的作用,其基因突变能导致青幼年发病的成年型糖尿病(maturityonsetdiabetesoftheyoung,MODY)的发生'".基于Cre?616?loxP条件性基因打靶技术,本室构建了肝脏特异性敲除模型鼠肝

14、组织中葡萄糖激酶的蛋白表达显着降低,由此我们推测葡萄糖激酶缺陷是导致该模型肝糖原含量减少的机制之一,进而使血糖水平升高,引发糖尿病本实验成功构建了4种糖尿病小鼠模型,并发现糖尿病小鼠模型均出现不同程度的肝糖原和肌糖原含量降低因此,我们认为糖原代谢在糖尿病的发病过程中起着重要的作用,糖原代谢异常是引发血中葡萄糖浓度升高的重要因素=此外,我们证实了葡萄糖激酶缺陷是引起葡萄糖激酶基因敲除模型肝糖原含量降低的分子机制之一=那么,其它糖尿病模型糖原含量降低的内在分子机制又是什么呢?进一步的实验研究将为糖尿病的防治和降血糖药物的研究提供一定的实验依据.参考文献1ZhangYL.TanXH.XiaoMF.&

15、quot;H.MaoYQ.TanHR.iniee:anewanimalmodelforscreeningantidiabeticdrugsJ.ActaPharmacolSin,2004;25:1659652林志彬.抗糖尿病药物实验法A.见:徐叔云.如濂.ChinJClinPharmaolTher2005Jun;10(6)陈修,主编.药理实验方法学M.第3版.北京:人民卫生出版社,2002:1516293ShulmanGI,RothmanDL.JueT.SteinP.DeFronzoRA.malsubjectsandsubjects,thnoninsulindependentdiabetesby

16、13CnuclearmagneticresonancespectroscopyJ.NEnglJMed,l990;322:2238mellituslJj.AmJPhysiolEndocrinolMetab,2004;287:El00275BisehofMG.BemroiderE.KrssakM,KrssakM.KrebsM,'afterlongternlnearnormogl(,lJJ.,;l:.semiaDiattes2002549546KrssakM,BrehmA,Berm'oiderE,AnderwaldC,Nowotonycogenmetabolismintype2r1i

17、abeteslJJ.Diabetes,2004;53:3O4856酶活性的改变J.北京医科大学,1998;30:468metabolismintheliverlJJ.BiochemJ,1998;336:193l9VelhoG,RobertJJ.Matm'ityonsetdiabetesoftheyoung(MODY):geneticandclinicalcharacteristicsJJ.HormRes,2002;57:2933onsetdiabetesoftheyoung(MODY).MODYgenesandnoninsulindependentdiabetesmeHituslJj.

18、DiabetesMeta1).1997;23:347ComparativestudyonchangesofglycogenmetabolisminmodelmiceofdiabetesmellitusXIAOMeifang,ZHANGXuemei,BAIXiang,TANHuanranDepartmentofPhatacolog),SchoolofBask'MedicalScience,PekingUniversi0,Beijing100083,China;DepartmentofPharmacolog),SchoolofBasicMedk'alScience,DalianUn

19、iversit)',Dalian116622,Liaoning,ChinaABSTRACTAIM:Toexplorethechangesofglycogenmetabolismindiabeticanimalmodelsandtheroleofglycogenmetabolisminthepathogenesisofdiabetesmellitus.METHODS:Firstlyfourtypesofdiabeticanimalmodelsweregeneratedincludingmicemodelsoftype1andtype2glycogencontentsofthesediabeticmiceweredeterminedaccordingtoanthronereagentmethodandglucokinaseexpressionsinliverofglucokinasegeneknockoutmicewereassayedusingwesternblo