柿叶黄酮对离体心脏缺血再灌注损伤的干预作用

1、柿叶黄酮对离体心脏缺血再灌注损伤的干预作用【摘要】目的观察柿叶黄酮（PLF）对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的干预作用。方法48只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组，心肌缺血再灌注组，PLF高、中、低剂量组，阳性药对照组。离体大鼠心脏采用Langendorff法灌流，停灌30 min再灌30 min造成心肌缺血再灌注损伤模型。观察PLF各组对冠脉流出液中天门冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性以及心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和丙二醛(MDA)含量的影响。结果PLF高、中剂量均可显著改善缺血再灌注所致的心功能损伤

2、，减少AST 、CK和LDH的释放以及心肌组织MDA的产生，增加SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性（P0.01或P0.05）。结论PLF对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用, 其机制可能与提高SOD活性、抗氧自由基、减少脂质过氧化反应有关。 【关键词】 柿叶黄酮； 缺血再灌注； 自由基Preventive Effect of Persimmon Leaf Flavones against Rat Myocardial Ischemic and Reperfusion InjurySUN Yi, TAN Hongdi, LAN Xiaobu, HUANG Jianchun, H

3、UANG Renbin*（Department of Pharmacology, Guangxi Medical University, Nanning, Guangxi 530021, China）Abstract：ObjectiveTo observe the preventive effect of Persimmon leaf flavones（PLF） on rat myocardial ischemic and reperfusion (I/R) injury. Methods48 Wistar male rats were randomly divided into contro

4、l, I/R group, high-, medium- and low-dose PLF groups, and verapamil (Ver) group. The isolated perfused rat hearts were set up by Langendorff-perfusion system. Myocardial ischemia reperfusion injury was induced by 30 minutes global ischemia followed by 30 minutes reperfusion. The activities of aspart

5、ic transaminase（AST）, creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH) in the effluent from aeteria coronaria were measured to evaluate the injury of myocardial cells and the protective effect of PLF. Meanwhile, the activities of superoxide dismutase (SOD), Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase, and the co

6、ntent of malondialdehyde (MDA) in myocardial tissues were determined.ResultsHigh- and medium-dose PLF could obviously recover cardiac function, reduce the releases of AST, CK, LDH from I/R rat hearts, increase the activities of SOD, Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase, and decrease the MDA product (P0.05)

7、. ConclusionPF may offer myocardial protective effect against I/R injury. The mechanism may be related to attenuating free radicals.Key words：Persimmon leaf flavones; Ischemia-reperfusion; Free radical 心肌缺血再灌注损伤是指心肌缺血一定时间再重新恢复血液供应后,心肌不一定都会恢复其正常功能和结构,反而出现心肌细胞损伤加重的表现,如心律失常、出血性坏死、梗塞面积扩大、心功能低下等现象。目前认为，其

8、发生机理主要与再灌注后细胞内Ca2+超载、氧自由基大量生成、微血管内皮细胞损伤等有关1。在我国，柿叶资源非常丰富，柿叶中的黄酮类成分为作用于心血管系统的主要有效成分2。近年来,有关黄酮类物质抗心肌缺血再灌注损伤的报道很多3,而柿叶黄酮是否具有抗心肌缺血再灌注损伤作用尚未见报道。我实验室近几年对柿叶黄酮进行了大量而深入的研究，发现其对心血管系统具有多方面的生物活性。本文对其抗心肌缺血再灌注损伤的作用进行探讨。1 材料1.1 动物健康Wistar大鼠48只，体质量（25030）g，雄性，由广西医科大学实验动物中心提供。1.2 药品柿叶黄酮，由本实验室自行提取；盐酸维拉帕米注射液，上海禾丰制药有限公

9、司出品，批号：060901。1.3 仪器及试剂722N可见分光光度计，由上海精密科学仪器有限提供；Langendorff离体心脏灌流实验系统，由上海奥尔科特生物科技有限公司提供；ALC-B5恒流泵，由上海奥尔科特生物科技有限公司提供。 CK试剂盒、LDH试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒、Na+-K+-ATP酶试剂盒、Ca2+-ATP酶试剂盒及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供；AST试剂盒，由英国朗道公司提供；其余试剂均为分析纯。1.4 主要试剂的配制K-H液配方(gL-1) 4: NaCl 6.92，KCl 0.35，CaCl2 0.28， MgSO47H2O 0.2

10、9，KH2PO4 0.16, NaHCO3 2.1, Glucose 2.0, pH 7.4。2方法2.1 大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型制备5将大鼠击枕致昏，打开胸腔，迅速取出心脏置于预冷(4)的K-H缓冲液中，轻轻挤压心脏，排空心脏内残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff离体心脏灌流装置中。心脏用饱含95%O2和5%CO2的K-H缓冲液（370.5）,pH7.4恒压逆行灌流(压力高度为80 cm水柱)。心脏均在平稳30 min后停灌30 min，然后再灌注30 min造成缺血再灌注损伤模型。大鼠随机分成6组: 正常对照组（control），持续灌流90 min；缺血再灌注组

11、(I/R)；PLF高剂量组（PLFH，含黄酮810-3gL-1）；PLF中剂量组（PLFM，含黄酮410-3gL-1）；PLF低剂量组（PLFL，含黄酮210-3gL-1 ）；维拉帕米组（Ver，浓度0.2510-3gL-1)。以上各组在停灌前10 min时分别加入不同浓度的含药灌注液，并持续整个再灌注过程。除control组外,其他各组离体心脏均停灌30 min，再灌注30 min。2.2 心肌生化指标的测定 收集再灌注后30 min时冠脉流出液，按试剂盒说明书测定冠脉流出液中AST，CK，LDH的活性。灌流末取各组大鼠左室全层心肌，4冰浴下制备成10%的匀浆，低温离心后取上清液，-80冻存

12、。按照试剂盒说明测定脂质过氧化产物MDA含量、SOD活性、Na+-K+-ATP酶活性及Ca2+-ATP酶活性。2.3 统计学处理 数据以s表示，组间显著性差异用t检验进行。3 结果3.1 对心肌组织中MDA含量及SOD活力的影响I/R组心肌组织中MDA含量明显增加，而SOD的活性明显降低，与control组比较均有显著性差异（P0.01）。与I/R组比较，PLF各剂量组中MDA含量显著降低（P0.05或P0.01），SOD活性显著升高（P0.05或P0.01）。结果见表1。表1 PLF对大鼠心肌组织SOD活力和MDA含量的影响（略）3.2 对心肌ATP酶活性的影响I/R组心肌组织Na+-K+-

13、ATP酶和Ca2+- ATP酶活性均明显降低，与control组比较均有显著性差异（P0.01）。PLFH、PLFM组中的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均较I/R组显著增高 (P0.05或P0.05)。结果见表2。表2 PLF对大鼠心肌组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的影响（略）3.3 对心肌缺血再灌注损伤时心肌酶活性的影响I/R组冠脉流出液中AST、CK、LDH活性与control组比较明显升高（P0.01）。与I/R组比较，PLFH、PLFM组可显著降低冠脉流出液中AST、CK、LDH活性（P0.05或P0.05)。结果见表3。表3 PLF对大鼠心肌酶活性的

14、影响（略）4 讨论 心肌缺血-再灌注损伤发生机制目前公认为毒性氧自由基学说和钙离子超负荷学说。氧自由基过量生成和（或）细胞内抗氧化防御系统受损导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对机体造成损伤，即氧化性应激损伤6，7。大量的氧自由基使心肌细胞膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化8,并因此生成脂质过氧化物（MDA等）而破坏细胞膜引起细胞损伤。SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损害。PLF可以显著提高缺血再灌注心肌细胞中SOD的活力，增强内源性氧自由基清除系统的功能，阻止MDA含量增加,从而减轻了缺血再灌注对细胞膜的损害。 细胞内钙超载导致细胞破坏是细胞死亡的共同通路。Na+/Ca2+交

15、换是导致钙超载的主要途径，缺血期间缺血心肌细胞内酸中毒,通过H+/Na+交换，使心肌细胞内Na+增加，持续缺血抑制Na+-K+-ATP酶活性，使心肌细胞内Na+进一步增加，后者激活细胞膜上Na+/Ca2+交换蛋白，加之Ca2+通道活性化及特异性膜离子通透性增强，因而在心肌再灌注时，随着Na+移向细胞外，大量的Ca2+进入细胞内；同时Ca2+的排出受到抑制，使心肌细胞内钙超载，引起过度收缩，致使细胞膜和闰盘撕裂，酶、肌红蛋白等物质外漏，造成心肌缺血再灌注损伤8。且Sjaastad等9研究发现，心肌梗死后存活心肌细胞更容易出现钙超载,因而更容易受缺血再灌注损伤。PLFH、PLFM组的Na+-K+-

16、ATP酶和Ca2+- ATP酶均比I/R组有非常明显升高，有助于Ca2+转运至胞外和胞内Ca2+库，减轻细胞内钙超载，防止钙离子本身及其续发效应如参与自由基产生等所致的细胞损伤。这可能是PLF减少心肌缺血再灌注损伤的机制之一。 缺血再灌注损伤使心肌细胞膜受损，心肌出现变性、坏死，心肌细胞内AST、CK、LDH等外逸。PLFH、PLFM组可显著地抑制心脏缺血再灌注所导致的CK、LDH活性的升高，提示其可减轻心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞的破坏。 上述结果提示，PLF对大鼠心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用，这可能与其提高心肌清除氧自由基的能力，减轻心肌细胞变性、坏死有关。【参考文献】 1Kato

17、R, Foex P.Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia/reperfusion injury :an update for anesthesiologistsJ.Can J Anaesth, 2002, 49(8): 777.2谭仁祥. 植物成分分析M. 北京：北京科学出版社,2002:486.3赵芳,徐立,许立. 参附注射液对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用J.中药新药与临床药理,2007,18(1):17. 4张建华,武 征,陈志武. 杜鹃花总黄酮预处理对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用J. 安徽医科大学学报,2006,41(3):286.5徐叔云,卞如濂,陈 修. 药理实验方法学，第3版M. 北京:人民卫生出版社, 2003:1060.6Bassenge E, Schneider HT, Daiber A, Oxidative stress and cardiovascular diseasesJ. Dtsch Med Wochenschr, 2005, 130(50):2904.7Madamanchi NR, Vendrov A, Runge MS. Oxidati