抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定

1、抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定 08-12-23 12:52:00 作者：缪峰 编辑：studa20【摘要】 目的：制备兔抗果蝇Trio蛋白的抗体。方法：以RTPCR扩增Trio的1 173 bp的基因片段并克隆入pET28a() 和pGEX4T1 (His)6C表达载体中，表达并纯化TrioHis、TrioGST融合蛋白。用纯化的TrioHis融合蛋白免疫家兔产生抗Trio的抗体，用TrioGST亲和层析法进行纯化并采用Western blot法检测抗体生物学活性。结果：表达的TrioHis蛋白以包涵体的形式存在，用His亲和层析法分离纯化后得到较纯的TrioHis融合蛋白，以纯化的Tr

2、ioHis免疫家兔制备的兔抗Trio的抗体，经Western blot分析显示该抗体可与果蝇S2细胞Trio特异性结合。结论：获得具有良好特异性的兔抗Trio抗体，为进一步研究Trio的功能奠定了基础。 【关键词】 Trio基因 原核表达 抗体制备 Trio基因是Dbl家族重要的一员，它编码的蛋白在人、小鼠、线虫、果蝇中具有高度的保守性。Trio能够活化Rho家族的GTPases，可能参与多种信号通路，已经发现它在轴突导向、神经细胞延伸和迁移中起着非常重要的作用，但该基因在果蝇中的功能尚不清楚 。本研究采用原核表达系统 制备并纯化了TrioHis融合蛋白，以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得抗T

3、rio抗体，为进一步研究Trio蛋白的功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 大肠杆菌DH5、BL21(DE3)由本实验室保存。质粒pET28a()、pGEX4T1 (His)6C为Novagen公司产品；逆转录酶购自Promega公司，限制性内切酶、T4连接酶及高保真DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；小量胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品；His亲和层析柱购自Clontech公司，CNBr活化的抗体纯化亲和层析柱Sepharose 4B为Amersham Pharmarcia公司产品；Western blot显影底物及BCA蛋白定量试剂盒均为Pierce公司产品,抗果蝇Tubuli

4、n抗体购自Sigma公司,HRP标记的羊抗兔IgG为Promega公司产品；雄性新西兰家兔体质量约2.5kg,购自本校实验动物中心。 1.2 方法 3GCGCGGATCCGCCAGCCCCGGCAAATGG3，下游引物的序列为5GCGCCTCGAGTTTGGTTGACAGGGGATTGG3（划线部分分别为BamH、Xho 酶切位点）。PCR反应的参数为：94 预变性3 min；94变性30 s，53变性1 min，72 延伸1 min，共34个循环;最后72 延伸10 min。获得Trio 1 173 bp的基因片段。4T1 (His)6C于16 连接过夜。以连接产物转化大肠杆菌DH5，并涂布

5、于含相应抗生素质粒pET28a()为卡那抗性,终质量浓度为25 mgL-1；质粒pGEX4T1 (His)6C为氨苄抗性，终质量浓度为50 mgL-1的固体培养基上，于37 过夜培养。挑阳性菌落，提取质粒，进行BamH 、Xho 酶切和测序鉴定，得到重组质粒pET28a()-Trio和pGEX4T1 (His)6CTrio。Trio和pGEX4T1 (His)6CTrio分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中，于37 培养过夜。次日按150接种至1 L含卡那霉素（终质量浓度为25 mgL-1）的新鲜LB液体培养基中，于37 振荡培养至细菌浓度的A600 nm约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1

6、 mmolL-1，于37 诱导表达3 h，离心收集菌体。菌体用1PBS(pH 7.4)重悬，经超声裂解后，以10 000 rmin-1离心10 min收集上清和沉淀。经SDSPAGE分析表明，表达的目的蛋白主要位于包涵体内。用缓冲液A(8 molL-1尿素、100 mmolL-1 NaH2PO4、10 mmolL-1 TrisHCl，pH 8.0)溶解包涵体，取上清于Ni2+NTA树脂层析柱中;用缓冲液B(8molL-1尿素、100 mmolL-1 NaH2PO4、10 mmolL-1 TrisHCl，pH 6.3)洗柱，直至A280 nm0.01;用缓冲液C(8 molL-1尿素、100 m

7、molL-1 NaH2PO4、10 mmolL-1 TrisHCl， pH 4.5)洗脱目的蛋白。收集的目的蛋白用SDSPAGE进行分析。His融合蛋白用BCA蛋白定量试剂盒进行定量后免疫家兔2只，每只每次融和蛋白的用量为200 g。初次免疫用完全弗氏佐剂乳化蛋白,皮下多点注射，2周后加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化蛋白。以后每间隔2周加强免疫1次,共加强免疫3次。经心脏取血,并分离血清，加0.2 gL-1叠氮钠后于-70 保存备用。Trio融合蛋白分别与CNBr活化的Sepherase 4B层析柱结合，制备亲和层析柱(按Sigma公司操作手册)。将免疫血清加于该层析柱中于4 结合过夜。次日依次

8、用1PBS(pH7.4)、1PBS(含2 molL-1 NaCl, pH 7.4)、1PBS(pH 4.5)洗涤杂蛋白，最后用0.1 molL-1甘氨酸溶液(pH 2.8)进行洗脱。将洗脱液与1 molL-1 TrisHCl(pH 9.5)溶液按201的比例混合,加入1 gL-1 NaN3,于4 保存备用。 2 结 果 2.1 重组载体的构建与鉴定 用Trizol试剂从野生型黑腹果蝇W1118的幼虫中，提取总RNA，以紫外分光光度计测得A260 nm/A280 nm=1.92。经琼脂糖凝胶电泳显示，出现28S、18S及5S 3条带，说明RNA的纯度及完整性均符合要求。以果蝇幼虫总RNA的cDNA为模板，进行PCR扩增Trio的基因片段，用BamH 、Xho 双酶切后，克隆到载体pET28a() 和pGEX4T1 (His)6C中。提取阳性的重组质粒，用BamH 、Xho 双酶切后得到1 173 bp的基因片段（图1）。经测序鉴定表明，阅读框架未变。得到重组质粒pET28a()Trio和pGEX4T1 (His)6CTrio。 A: 1. DNA相对分子质量标准（DL2000）；2