心肌缺血预处理对未成熟心肌细胞凋亡的影响

1、心肌缺血预处理对未成熟心肌细胞凋亡的影响         07-11-16 16:53:00     编辑：studa20               作者：孙忠东，池一凡，杨铁南，侯文明，牛兆倬，唐子龙 【关键词】  缺血预处理    摘要：目的  探讨心肌缺血预处理(MIP)对未成熟心

2、肌bcl-2、bax、fas蛋白表达的影响。方法 采用兔Langendorff模型，24只幼兔随机分为3组，对照组(C,n=8)：仅灌注KH液180min，然后取标本；缺血/再灌注组（I/R, n=8）：灌注20min后，停灌45min，复灌120min；心肌缺血预处理组(MIP, n=8)，灌注20min，反复2次停灌5min，复灌5min，然后重复I/R组缺血/再灌方法。以凋亡细胞原位标记、琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段梯及bcl-2、bax、fas蛋白表达作为检查指标。结果 琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段梯：MIP组与I/R组比较，光密度明显减弱； MIP组与I/R组比较，bcl-2表达明显

3、增多，bax、fas表达明显减少。结论 MIP通过影响bcl-2、bax、fas基因蛋白的表达减少心肌细胞凋亡。关键词： 缺血预处理；心肌；细胞凋亡；基因蛋白The Effects of Myocardial Ischemic Preconditioning on Immature Myocardial Cell Apoptosis Abstract: OBJECTIVE To investigate the effects of myocardial ischemic preconditioning (MIP) on immature myocardial cell apoptosis an

4、d  expression of bcl-2,bax,fas protein .METHODS Isolated working rabbit heart model was used in this study, 24 rabbits (aged 1421 days) were divided into 3 groups (n=8) . Control group was only perfused with Krebs-Henseleit (KH) 180 minutes. Ischemia/reperfusion(I/R) group was perfused 20 minut

5、es ,and then kept under ischemia 45 minutes, followed by reperfustion 120 minutes. Myocardial ischemic preconditioning (MIP) group was perfused 20 minutes ,and then repeatly ischemia 5 minutes followed reperfusion 5 minutes 2 times,finnaly reperfused 120 minutes. Such indexes, including the TUNEL, n

6、ucleosomal ladder of DNA fragments, and the expression of bcl-2, bax,and fas gene were detected.RESULTS  MIP group there was reduction in TUNEL cell apoptosis, ladder of DNA fragments,expression of bax and fas gene,and increase in expression of bcl-2 gene.CONCLUSION  This study demonstrate

7、d that MIP decrease immature myocardial cell apoptosis by affecting the expression of bcl-2, bax,and fas gene .Key words：Ischemic preconditioning;Myocardial; Apoptosis;Gene proteins细胞凋亡(apoptosis)是指有核的细胞在一定条件下通过启动自身的机制而发生的一种自然死亡过程。细胞凋亡广泛参与机体的正常发育和各种病理生理过程。细胞凋亡发生不足或凋亡过度均可以导致机体发生多种病理生理变化。在成熟心肌实验表明MIP可

8、减少心肌细胞凋亡的发生，其中bcl-2、bax、fas等基因蛋白的表达在细胞凋亡中起重要作用。MIP对未成熟心肌细胞凋亡有否影响，尚未可知。本实验目的观察MIP对未成熟心肌细胞凋亡和bcl-2、bax、fas等基因蛋白的表达的影响。1 材料与方法  1.1  动物模型的建立                      出生1421d的健康新生长耳大白兔24只，雌雄不拘。

9、开胸，右心耳注入肝素(300IU/kg)，切开主动脉插入灌注管，即行KH液Langendorff灌流，灌注压为45mmHg。切取心脏，结扎肺静脉，剪开左心耳将内径3mm左房灌注管插入左房，内径1mm测压管插入左心室。左房灌注压为7.5mmHg，左心后负荷为22.5mmHg。KH 缓冲液成分(mmol/L) :NaCl 118.5, KCl 4.70,CaCl2 2.50, MgSO4 1.20, NaHCO3  25.00, KH2PO4 1.20, Glucose 11.10,Na2EDTA 0.50。使用时新鲜配制，经0.45m 滤器过滤，灌流前给予体积分数为95%O2和5%CO

10、2混合气体按1.5L/min向储液瓶内的灌流液中通气30min，灌流液维持在37，pH为7.4，渗透压为320330mOsm/L。1.2 分组及方法                      随机分为3组,常规建立Langendorff模型。对照组（C）组：仅灌注KH液180min，然后取标本。缺血/再灌(I/R)组：灌注20min后，停灌45min，复灌120min。MIP组：灌注20

11、min，反复2次停灌5min/复灌5min，然后重复I/R组缺血/再灌方法。1.3检测指标及方法                      凋亡细胞原位标记与半定量分析  左室心肌组织常规石蜡包埋，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(terminal transferase UTP nick end labeling,TUNEL)1标记凋亡

12、细胞核中DNA3-OH末端，经脱蜡，洗脱，消化，孵育，洗脱，NBT-BCIP显色，镜下观察。根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片拍摄5个阳性视野，每视野记数300个心肌细胞中阳性细胞数，以平均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI)。琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段梯   采用快速法检测DNA片段梯2。Bcl-2、bax、fas基因蛋白的表达   采用Western blot法。用2×SDS样品缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，经SDS-PAGE分离后迅速转移至尼龙膜，按分子克隆实验指南加入单抗(1:1000)及碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG(1:1000)用BCIP/NBT显色3。1.4 统计学处理                      数据以均数±标准差（ ±s）表示，采用方差分析方法，P<0.05差异有显著性。2  结果2.1 亡细胞原位标记与半定量分析      &#