氧自由基在肝缺血再灌注损伤中的作用及川芎嗪的影响

1、    氧自由基在肝缺血再灌注损伤中 的作用及川芎嗪的影响        摘要目的：探讨氧自由基在肝缺血再灌注损伤(HIRI)中的作用及川芎嗪的防护作用。方法：应用HIRI家兔及肝癌手术患者，观察超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，黄嘌呤氧化酶(XO)、谷丙转氨酶(ALT)活性、丙二醛(MDA)含量、肝细胞形态学变化及川芎嗪对上述指标的影响。结果：HIRI时SOD、GSH-PX活性显著下降(P0.05和P0.01)，XO、ALT活性及MDA

2、含量明显升高(P0.05和P0.01)，肝细胞形态学发生异常变化；使用川芎嗪后，上述指标的异常变化均明显减轻，其差异有显著和非常显著(P0.05和P0.01)。结论：氧自由基是HIRI的重要发病学因素，而川芎嗪通过清除氧自由基可减轻HIRI。主题词氧自由基； 肝脏； 再灌注损伤； 川芎嗪 Role of oxygen free radicals in reperfusion injury following hepatic ischemia and effect of ligustrazinWANG Wan-Tie, LIN Li-Na, XU Zheng-Jie, LI Dong, WANG

3、 Zhong-MinDepartment of Pathophysiology, Wenzhou Medical College, Wenzhou(325003)AbstractAIM：To explore the role of oxygen free radicals (OFR) in hepatic ischemia-reperfusion injury (HIRI) of rabbits and humans and the protective effect of ligustrazin (LGT). METHODS: Changes of several parameters an

4、d effects of LGT on it were observed during HIRI in 20 rabbits and 18 patients who suffered from cancer of the liver and were scheduled for elective hepatic surgery, parameters of which included superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-PX), xanthine oxidase (XO), alanine aminotransfera

5、se (ALT) and malondialdehyde (MDA) as well as morphological changes of hepatocytes.RESULTS: SOD and GSH-PX activities decreased significantly (P0.05) and very significantly (P0.01), XO and ALT activities as well as MDA concentration increased remarkably (P0.05 and P0.01), and abnormal morphological

6、changes of hepatocytes were obvious during HIRI; with treatment of LGT, the abnormal changes of all above parameters were diminished remarkably (P0.05 and P0.01). CONCLUSION: It is indicated that OFR may be one of the primary causes for HIRI, LGT can attenuate HIRI by eliminating OFR.MeSHOxygen free

7、 raddicals; Liver; Reperfusion injury; Ligustrazin氧自由基损伤可能是肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-heperfusion injury, HIRI)的重要机制之一13。本研究旨在通过测定HIRI家兔及人体血浆、肝组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性、丙二醛(malondi

8、aldehyde, MDA)含量的变化及观察肝细胞形态学的变化，了解川芎嗪(ligustrazin, LGT)对上述指标的影响，探讨川芎嗪抗HIRI的机理，为加强围手术期肝脏的保护提供理论依据。材料和方法一、对象选择和分组：(一)健康家兔(日本大耳白兔)20只，雌雄兼有，体重2.02.5 kg，制备HIRI模型4。随机分为两组：对照组(I-R+NS组)，10只，生理盐水1.5 mL/kg,BW分别在肝缺血前20 min和再灌注即刻静脉注入；川芎嗪组(I-R+LGT组)，10只，将生理盐水改为盐酸川芎嗪注射液30 mg/kg,BW(广东省湛江制药厂，批号880201,每支40 mg*2 mL-1

9、)，余同对照组。(二)18例肝癌患者，男13例，女5例，年龄3165岁，平均45岁，体重4061 kg，平均51 kg，均行择期肝叶切除术。随机分成两组：对照组(I-R+NS组)，9例，生理盐水0.15 mL/kg,BW分别在肝门阻断前20 min及再开放即刻恒速静脉滴入(2 min内)；川芎嗪组(I-R+LGT组)，9例，将生理盐水改为盐酸川芎嗪注射液3 mg/kg，BW,余同对照组。两组患者性别、年龄、体重及肝门阻断时间均无显著差异，具有可比性。二、样品采集：(一)两组家兔分别在肝缺血前，缺血45 min及再灌注45 min自颈外静脉取血，以测定血浆SOD、GSH-PX、XO及MDA水平，

10、并在再灌注45 min迅速处死，取肝左中叶组织约100 mg，制成匀浆测定SOD、GSH-PX、XO活性及MDA含量。同时取少许肝左中叶组织行光镜、电镜观察。(二)两组肝手术患者分别在肝门阻断前(缺血前)、阻断25 min(缺血25 min)及再开放25 min(再灌注25 min)自颈内静脉取血，以测定血浆SOD、GSH-PX、XO、ALT及MDA水平。三、检测方法：采用黄嘌呤氧化酶法测定血浆SOD活性，化学比色法测定GSH-PX及XO的活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，赖氏法测定ALT值，前4种试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。HE染色光镜观察，LKB-V型超薄切片机切片，H-500

11、型透射电镜观察。四、统计处理：数据均以±s表示，采用组间、组内t检验判断差异显著性。结果一、两组家兔HIRI时血浆和肝组织SOD、GSH-PX、XO活性及MDA含量的变化，见表1。表1两组家兔HIRI时血浆和肝组织蛋白的SOD、GSH-PX、XO活性及MDA含量的变化Tab 1 Changs of SOD， GSH-PX， XO activities and MDA content in plasma andhepatic tissue protein during HIRI between I-R+NS and I-R+LGT(±s,n=10)GroupSOD(×

12、;16.67×10-6mol·s-1)GSH-PX(×16.67×10-6mol·s-1)XO(×16.67×10-9mol·s-1)MDA(mol/L)PlasmaControlPre-Is350±27l80.0±16.72.10±1.055.70±0.50(I-R+NS)Is 45 min ?251±31*720±14.3*3.50±1.74*6.00±0.55*Rp 45 min171±22*620±19.8*

13、4.60±1.84*7.70±0.66*I-R+LGTPre-Is350±27720±15.61.90±0.765.70±0.47Is 45 min341±24710±15.02.30±0.685.90±0.65Rp 45 min331±4268.0±15.0*2.60±0.52*6.10±0.64*Hepatic tissue(×16.67×10-9mol·s-1)(×16.67×10-9mol·

14、;s-1)（×16.67×10-9mol·s-1)(nmol/mg)Control477±8924.0±3.77.90±3.961.90±0.25（I-R+NS）I-R+LGT704±4533.0±4.84.30±2.481.40±0.23*P0.05，*P0.01,vs Pre-Is;P0.01 vs Is 45 min; P0.05,P0.01,vs control group; I-R-ischemia-reperfusion; Is=ischemia; Rp=reperfusi

15、on; NS=normal saline; LGT=ligustrazin 表2两组患者血浆SOD、GSH-PX、XO活性及MDA含量的变化和比较Tab 2 The change and comparison of SOD, GSH-PX, XO activities and MDA content in plasma among 18 patients (±s, n=9)GroupSOD(×16.67×10-6mol·s-1)GSH-PX(×16.67×10-6mol·s-1)XO(×16.67×10-

16、9mol·s-1)MDA(mol/L)ALT(×16.67×10-9mol·s-1)ControlPre-Is102±12205±240.70±0.593.30±0.3928±8（I-R+NS）Is 25 min80±10*173±18*1.00±0.70*5.20±0.78*95±12*Rp 25 min69±15*154±18*1.50±1.1*6.80±0.41*126±15*I-R+LGTPre-I

17、s103±13205±220.80±0.513.30±0.3929±8Is 25 min98±13197±191.00±0.443.70±0.8434±9Rp 25 min89±20183±191.10±0.40*3.70±0.5841±16*P0.05，*P0.01, vs Pre-Is;P0.05， P0.01,vs Is 25 min;P0.05,P0.01, vs control group二、两组肝手术患者HIRI期间血浆SOD、GSH

18、-PX、XO、ALT活性及MDA含量的变化，见表2。三、肝细胞形态学改变：(一)光镜下见，对照组肝细胞肿胀，脂肪变性、空泡变性及点状坏死；川芎嗪组表现为散在的肝细胞肿胀、变性及点状坏死，其程度、范围均明显轻于对照组。(二)电镜下见，对照组线粒体、内质网肿胀，毛细胆管腔内微绒毛稀少，川芎嗪组毛细胆管的微绒毛形态基本正常，数量不少，线粒体、内质网肿胀的程度和范围均显著轻于对照组。 讨论肝缺血再灌注时，机体可通过多种途径产生大量氧自由基，氧化膜磷脂中的多双键不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，导致肝细胞损伤。而氧自由基清除剂SOD，脂质过氧化反应代谢产物MDA等是目前公认的能较好反映体内氧自由基水平及

19、脂质过氧化损伤程度的间接指标。表1和表2显示：HIRI期间，血浆XO活性明显升高，SOD及GSH-PX活性显著下降，MDA水平明显增高，尤以再灌注期为著；同时伴随ALT值进行性增高及肝组织学和超微结构的异常变化；而且MDA水平与ALT值的变化呈显著的正相关(r=0.444,P0.05)。表明体内氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，氧自由基大量生成而清除减少，体内氧自由基水平急剧升高，从而引发一定程度的脂质过氧化反应，以致共同造成HIRI。由此可见，氧自由基及其引发的脂质过氧化反应是HIRI的主要因素之一。本实验结果显示，川芎嗪组家兔肝细胞形态学异常改变明显较对照组轻；患者血浆ALT值也显著低于对

20、照组(P0.01)。提示川芎嗪有明显的抗HIRI作用。以往实验证实57，川芎嗪能增加休克及心肌缺血再灌注损伤时机体内源性SOD、GSH-PX活性，抑制XO活性，清除氧自由基，进而降低组织脂质过氧化程度，有效地防治缺血再灌注损伤。本实验结果显示，川芎嗪组家兔血浆及肝组织SOD、GSH-PX活性均明显高于对照组，XO活性及MDA含量均显著低于对照组；况且川芎嗪组患者血浆SOD、GSH-PX活性亦明显较对照组高，XO活性及MDA含量亦显著较对照组低。进一步证实了川芎嗪能有效地防治肝缺血再灌注时氧自由基的损伤。当然，川芎嗪不仅是一种氧自由基清除剂，而且也是一种钙通道阻滞剂8。此外，川芎嗪尚能有效地抑制

21、组织缺血时血小板聚集与激活9，调节循环血中血栓素A2/前列环素的平衡，遏制“无复流现象”，疏通微循环，有效恢复组织灌流10，从而起到抗HIRI的作用。*浙江省教委科研基金资助作者单位：王万铁徐正?温州医学院病理生理教研室(温州 325003)林丽娜附属一院麻醉科李东检验系分析中心王宗敏附属二院病理科参考文献1Kunz R, Brune HA, Ziegler U, et al. Ischemia-reperfusion damage of the liver caused by free radicals-direct detection using electron spin resonance (ESR). Langenbecks Arch Chir, 1991, 376:139.2Kobayashi H, Nonami T, Kurokawa T, et al. Mechanism and prevention of