曲克芦丁与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究

1、    曲克芦丁与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究曲克芦丁与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究 作者：孙荣梅， 于丽燕， 陈昌云    作者单位：(1.中国药科大学高职学院， 江苏 南京 211198; 2.南京晓庄学院化学系，江苏 南京 210017)【摘要】  目的： 应用光谱技术研究曲克芦丁(troxerutin, TRO)与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 间结合作用机制。方法： 通过荧光光谱法确定曲克芦丁对BSA的荧光猝灭机制。依据热力学参数讨论两者之间的主要作用力类型

2、。利用同步荧光光谱考察曲克芦丁对BSA构象的影响。结果： 曲克芦丁对BSA的荧光猝灭机制为静态猝灭;反应的热力学参数H=-77.06 KJ/mol，S=-152.20 J/(mol·K)。结论： 曲克芦丁与BSA之间的主要作用力是范德华力;曲克芦丁的加入使BSA构象发生了变化。【关键词】  牛血清白蛋白; 曲克芦丁; 荧光猝灭; 同步荧光光谱Spectroscopic studies on the interaction of troxerutinand bovine serum albuminSUN Rongmei1， YU Liyan1， CHEN Changyun2(

3、1.Vocational and Technical School of China Pharmaceutical University，Nanjing Jiangsu 211198; 2.Department of Chemistry， Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing Jiangsu 210017， China)Abstract Objective: Applied spectroscopy to study the interaction mechanism of troxerutin and bovine serum albumin(BSA)

4、.Methods： Fluorescence spectroscopy method was used to determine the fluorescence quenching mechanism of BSA caused by troxerutin.According to the thermodynamic parameters the major force types between troxerutin and BSA was discussd.The effect of troxerutin on bovine serum albumin was also studied

5、by synchronous fluorescence spectrometry.Results： The quenching mechanism of troxerutin to bovine serum albumin was static quenching.The thermodynamic parameters of the reaction was H=-77.06 KJ/mol，S=-152.20 J/(mol·K).Conclusion： The main binding force between troxerutin and BSA was Van derWaal

6、s interaction.Troxerutin binding on the bovine serum albumin could change the serum protein conformation.Key words bovine serum albumin; troxerutin; fluorescence quenching;synchronous fluorescence spectroscopy曲克芦丁(troxerutin,TRO)系芦丁经羟乙基化制成的半成品黄酮化合物。具有抑制红细胞和血小板凝结，防止血栓形成的作用;同时能增加血中氧的含量，改善微循环，促进新生血管形成以

7、增进侧支循环的开放1。结构见图1。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它能和许多内源性物质广泛结合。各种药物进入人体一般都要通过血浆的贮存和运输，而后才能到达受体部位并发生药理作用。研究药物与血清白蛋白的相互作用具有重要的理论意义2。蛋白质的功能与其结构密切相关，研究中药有效成分对蛋白质结构的影响，不仅能为确定中草药有效成分及作用强度提供一定信息，而且对全面阐明小分子化合物与蛋白质的结合机制也有重要意义，同时也有利于了解中药的作用机制。本文研究了TRO与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的作用机制以及温度对结合常数的影响。分析了TRO与BSA的结合模式，从分子

8、水平认识该反应的作用机制。图1 曲克芦丁的结构Fig 1 The structure of troxerutin1 材料与方法1.1 仪器和试剂TU1901PC型分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，LS50B型荧光分光光度计(美国PerkinElmer公司)，PHS25型PH计(上海雷磁仪器厂);TRO(中国药品生物制品检定所),牛血清白蛋白(Sigma公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、氯化钠等试剂均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水。1.2 溶液配制用0.9%NaCl配成pH=7.4的TrisHCl缓冲液来配制浓度为1.0×10-3 mol/L的TRO储备液备用;以Tri

9、sHCl缓冲溶液(pH=7.4，含0.1 mol/L NaCl 以维持溶液的离子强度)为溶剂配制1.0×10-4 mol/L 的BSA储备液备用。1.3 实验方法荧光光谱的测定：取3 ml 1.0×10-6 mol/L的BSA溶液于1 cm的石英比色皿中，用微量注射器逐次加入浓度为1.626×10-3 mol/L的TRO溶液进行滴定，加样体积由实验点浓度计算确定(滴定剂累加体积小于100 l)。以278 nm为激发波长，绘制300500 nm波长范围的荧光光谱;同步荧光光谱实验中同时扫描激发和发射单色器，固定激发和发射波长差分别为60 nm和20 nm，其他同荧光

10、光谱测量。紫外吸收光谱的测定：移取10 ml 1×10-4 mol/ L 的曲克芦丁溶液于10 ml比色管中,加入pH=7.4 的TrisHCl缓冲溶液定容至刻度,以TrisHCl 缓冲溶液做参比,测定紫外吸收光谱。2 结 果2.1 紫外光谱的研究由BSA,TRO及TROBSA(11)复合体系的紫外吸收光谱(图2)可以看出，TROBSA复合体系的吸收光谱与单独TRO,BSA的吸收光谱相比，发生了明显的减色效应。吸收光谱的变化表明TRO和BSA之间的相互作用是在基态分子中发生的。2.2 TRO对BSA的荧光猝灭研究蛋白质能够发出荧光是因为蛋白质中存在三种芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯

11、丙氨酸。由于这些氨基酸结构不同，其荧光强度之比为10090.5，因此大多数情况下可以认为蛋白质所显示的荧光主要由色氨酸残基贡献3。而当激发波长为278 nm时，TRO在300500 nm范围内几乎无荧光。固定BSA的量，不断增加TRO浓度时，BSA内源荧光强度有规律地降低，不同温度时的荧光猝灭曲线如图3,4所示。C(BSA)=1.0×10-6 mol/L;=278 nm;pH=7.4;C(TRO)(AF)：0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5×10-6 mol/L图3 25时TRO对BSA的荧光猝灭光谱Fig 3 Effect of TRO on fluorescen

12、ce spectrumof BSA at 25C(BSA)=1.0×10-6 mol/L;=278 nm;pH=7.4;C(TRO)(AF)：0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5×10-6 mol/L图4 37时TRO对BSA的荧光猝灭光谱Fig 4 Effect of TRO on fluorescence spectrumof BSA at 37荧光猝灭通常可分为动态猝灭和静态猝灭。一般情况下，可依据不同温度下的结果区别是动态还是静态猝灭。对于动态猝灭，随着温度的升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度升高而增大;若是静态猝灭则温

13、度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。为了进一步阐明其荧光猝灭机制，分别作出25 和37 时BSA猝灭的荧光光谱，根据SternVolmer方程4F0F=1+Kq0Q =1+KSVQ 式中F0和F分别为加入猝灭物质前后所测得的荧光强度值,0为没有猝灭物质存在时荧光分子的平均寿命。Kq为双分子碰撞猝灭常数,Q 为猝灭物质的浓度, KSV为SternVolmer猝灭常数,且有KSV=Kq0。绘制F0/F-1对Q 关系图,见图5。图5 25和 37时BSA 的SternVolmer图Fig 5 SternVolumer curve of BSA with TRO at25 and 37从图5可

14、以看出，曲线呈良好的线性关系，且随着温度的升高BSA猝灭曲线的斜率降低，可判断药物与BSA之间形成了复合物，猝灭过程为静态猝灭。2.3 结合位点和结合常数的确定药物分子和蛋白质分子间的相互作用一般采用位点结合模型来描述，设蛋白质分子(P)上对药物分子(Q)有N个等同独立的结合部位。蛋白质总浓度为Pt，药物总浓度为Qt，蛋白质和药物的游离浓度分别为P和Q，生成物为QnP，其浓度为QnP，则与蛋白质结合的药物当量数为nQnP，设结合常数为K，依据Scatchard方程5可知，确定猝灭机制后，再将所测得的各个荧光光谱，按349 nm处的相对荧光强度F0/F对C(TRO)F0/(F0-F)作线性拟合，

15、得到弱碱性条件下TRO与BSA形成复合物的结合常数、结合位点数和相应的直线相关系数，见表1。结果表明，TRO与BSA作用时只有1个结合点。表1 BSA和TRO的结合常数及方程的相关系数2.4 TRO与BSA作用力的确定药物与生物大分子的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等。药物不同，与蛋白质作用类型也不相同。根据热力学参数与作用力间的关系，可以确定其作用力类型。热力学参数与主要作用力间的相互关系如下6：H=0，S>0，为疏水作用力;H<0，S>0，为静电作用力;H<0，S<0，为范德华力。当温度变化不太大时，反应的焓变可看作一个常数，由式lnK2K1=

16、H(1T1-1T2)RG=H-TS=-RTlnK可求得25 时TRO与BSA反应的热力学参数H=-77.06 KJ/mol，S=-152.20 J/(mol·K)，G=-31.70 KJ/mol。所以可认为TRO与BSA之间的作用力主要为范德华力。2.5 TRO对BSA构象的影响同步荧光光谱经常被用来研究药物分子对蛋白质构象的影响。当同步扫描波长差为60 nm时，BSA的同步荧光主要是色氨酸残基发射的荧光，为20 nm时只表现出酪氨酸残基的荧光。而色氨酸的最大荧光发射波长与其所处的介质环境有关。因为氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境的疏水性有关，所以由发射波长的改变可判断蛋白质构象

17、的变化。BSA的空间结构由3个结构域组成，每个结构域由2个亚结构以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部构成疏水腔5。固定BSA浓度，逐渐增大TRO的浓度，记录=60 nm和=20 nm时的同步荧光光谱图,发现最大发射波长略有移动(图6)。表明TRO的加入导致了BSA构象的改变，色氨酸残基所处环境的疏水性降低,BSA 内部的疏水结构有所瓦解, 肽链的伸展程度增加7 。C(BSA)=1.0×10-6 mol/L; pH=7.4a：=20 nm; C(TRO)(A-E)：0,1,2,3,4,×10-6 mol/Lb：=60 nm; C(TRO)(

18、A-E)：0,1,2,3,4×10-6 mol/L图6 BSA的同步荧光光谱Fig 6 Synchronous fluorescence spectrum of BSA3 讨 论TRO对BSA产生荧光猝灭，且猝灭过程是由于形成化合物而引起的静态猝灭。因为动态猝灭是由分子的扩散碰撞导致的，随着温度的升高，分子的扩散速度加快，荧光猝灭会更严重，猝灭常数应更大。而静态猝灭温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。另外，据文献报道，生物大分子的荧光寿命约为10-8 s8，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数为2.0×1010 L·(mol·s)-

19、1,根据实验所得KSV值及SternVolmer方程，可以计算TRO对BSA的荧光猝灭速率常数Kq远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数。由此进一步证明，TRO对BSA的猝灭是由于形成了配合物而引起的静态猝灭。通过TRO与BSA荧光光谱的研究发现,不存在药物时的BSA荧光强度比存在药物时的BSA荧光强度强,表明BSA内色氨酸残基与TRO之间存 在能量转移。通过对TRO与BSA荧光光谱测定，发现BSA的内源荧光有规律地降低且略有红移现象。有研究9 认为色氨酸的最大荧光发射峰位对环境很敏感, 在疏水环境中其最大峰位约为332 nm，完全显露于水相中时约为352 nm，部分显露于水相中时则约为342 nm，由此可以认为TRO 与BSA 结合后, 使BSA 的螺旋结构逐渐舒展开来, 从而使色氨酸残基逐渐从白蛋白的疏水环境中显露出来而进入水相中, 导致BSA分子的空间构象发生了变化。【参考文献】  1 Petruzzelis V,T