抗呆合剂对小鼠缺血再灌注脑内氨基酸、乙酰胆碱酯酶活力的影响

1、    抗呆合剂对小鼠缺血再灌注脑内氨基酸、乙酰胆碱酯酶活力的影响*        摘要：反复脑缺血再灌注后50min，小鼠脑内谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)均升高，-氨基丁酸(GABA)，也随之升高。抗呆合剂大、小剂量均可抑制Glu、Asp的升高，大剂量还使升高的GABA恢复至接近正常。造模后50min以及7d，模型组小鼠乙酰胆碱酯酶(AchE)活力降低，抗呆合剂可升高AchE活力。关键词：脑缺血再灌；抗呆合剂；谷氨酸；乙酰胆碱酯酶；小鼠 Effects of Kan

2、gDaiHeJi on Intracerebral Amino Acid and AchE Activity of Ischemia Reperfusion MouseTang YipengZhao ShuminSun Liping,et al.(Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029)ABSTRACT：After repeated cerebral ischemia and reperfusion,50 minutes later, the mouse intracerebral glutamic acid (Glu) a

3、nd asparaginic acid (Asp) level increased, then the level of gamma aminobutyric acid (GABA) increased as well. Both large and small dose of Kangdaiheji (KDHJ) can inhibit the increase of Glu and Asp. A large dose of KDHJ can lower the GABA near to normal level. In 50 minutes to 7 days after creating

4、 the mouse model of which the acetylcholinesterase (AchE) activity was inhibited, KDHJ improved the AchE activity.KEY WORDS: Cerebral ischemia reperfusion; Kangdaiheji; Glu; AchE; Mouse 我们在前期研究中发现1，2，抗呆合剂可以改善小鼠脑缺血后的学习记忆障碍，并探讨了药物的部分作用机理， 主要是关于抗呆合剂对自由基损伤的作用。兴奋性氨基酸(EAAs)主要是谷氨酸， 乙酰胆碱(Ach)对脑缺血再灌注损伤以及其后的学

5、习记忆障碍有重要作用。在本实验中， 我们探讨了抗呆合剂对脑缺血再灌注小鼠模型脑内的兴奋/抑制氨基酸的作用， 并以乙酰胆碱酯酶(AchE)活力间接反映脑内Ach含量和代谢率， 观察了抗呆合剂的作用。1材料与方法1.1材料动物：昆明小鼠三级雄性2528g，卫生部生物制品鉴定所动物中心提供，实验室条件下自由饮食。试剂：谷氨酸(Glu)、-氨基丁酸(GABA)、天冬氨酸(Asp)标准品(Sigma公司)；氯化乙酰胆碱(Sigma公司)；三氯化铁(北京化工厂)；其余试剂均为国产化学纯。仪器：835-50氨基酸自动分析仪、低温离心机(HITACHI日本)；紫外/可见分光光度计UV-120-02(日本 Sh

6、imadzu);手术显微镜6212-型、7151型电子温度计(上海医用仪器厂)。药品：抗呆合剂由天麻素等药物组成，中药纯品由本校魏璐雪教授提供；尼莫地平片剂，山东新华制药厂生产，批号：9604081。1.2方法实验分组：动物随机分为假手术组、模型组，分别以生理盐水16.6mL/kg灌胃；抗呆合剂大、小剂量组，分别按10、5mg/kg灌胃；尼莫地平组，按50mg/kg灌胃。各组给药均为1次/d，从术前3d开始至取材日止。脑缺血再灌注模型制备：参照文献方法加以改进3，在水合氯醛350mg/kg麻醉下，颈正中切口解剖镜下分离双侧颈总动脉，以无损微动脉夹夹闭15min，再通15min，再次夹闭15mi

7、n，第1次缺血同时于鼠尾尖端剪断1cm放血0.3mL造成低血压。整个缺血过程中小鼠置于恒温箱内，保持肛温于36 左右。术后肌注青霉素0.2万U，腹腔注射生理盐水1mL。假手术组操作同模型组，但不夹闭动脉，不放血。取材方法：小鼠断头处死，迅速于冰盘上分离脑组织，取视交叉前2mm，后4mm之间区域内组织待用。观察项目：(1) Glu、GABA、Asp 测定：各组小鼠于手术后50min取材，加4%冷磺酸水杨酸，4离心20000r/min，10min。取上清100L， 氨基酸自动分析仪检测4。分析条件：分析柱26mm×150mm；缓冲液流速0.225mL/min。(2)乙酰胆碱酯酶活力测定：

8、取材时间为造模后50min及7d。样品以冷生理盐水制成20%匀浆，4500r/min，4离心5min，取上清液，参照文献5测定。以1mL上清液在37与乙酰胆碱底物作用20min分解1mol/L乙酰胆碱为1个胆碱酯酶活力单位。2结果2.1脑组织内Glu、GABA、Asp含量的变化脑缺血再灌注50min，模型组小鼠脑内Glu、Asp含量明显高于假手术组(P<0.001); GABA含量也升高(P<0.01)。抗呆合剂大、小剂量均可抑制脑缺血再灌造成的Glu、Asp升高；同时抗呆合剂大剂量也使升高的GABA降低接近于正常，而抗呆合剂小剂量则对GABA含量影响不明显。尼莫地平仅可降低Asp

9、含量(P<0.05)，见表1。表1脑缺血再灌50min脑内Glu、GABA、Asp含量的变化 组别nGluGABAAsp假手术组10971.47±111.29*424.08±106.85*289.12±50.17*模型组121499.33±201.49513.72±42.68418.55±33.99中药大剂量组121227.80±42.62*431.86±71.62*341.25±24.85*中药小剂量组81269.59±46.79*466.52±111.38339.56

10、7;51.86*尼莫地平组91420.45±204.89452.02±86.54377.51±37.21*     注：与模型组比较*P<0.05 *P<0.01 *P<0.001；与假手术组比较P<0.05P<0.01P<0.0012.2AchE活力的变化造模50min和7d后，脑组织内AchE活力变化见表2。表2脑缺血再灌50min和7d脑内AChE活力的变化组别再灌50 min再灌7 dnAchE活力nAchE活力假手术组819.73±1.18*1015.89±2

11、.24*模型组916.89±3.18813.42±2.70中药大剂量组921.61±2.86*916.68±2.84*中药小剂量组523.78±1.71*917.26±2.69*尼莫地平组822.14±2.24*916.47±1.65*     注：与模型组比较*P<0.05*P<0.01*P<0.001；与假手术组比较 P<0.053讨论3.1抗呆合剂的抗兴奋毒性作用脑缺血后脑组织中氨基酸类递质代谢异常，导致神经元损伤及神经功能损害，其中最重要的公认

12、为Glu的兴奋毒性作用。Glu的兴奋毒性机理主要有三种：一是经由AMPA受体和KA受体过度兴奋所介导的神经细胞急性渗透性肿胀，在数小时内发生，以Na内流，随即Cl-和H2O被动内流为特征。二是主要经NMDA受体过度兴奋介导的神经细胞迟发性操作，可推迟至数日发生，主要与Ca2+超载有关。这种迟发性损伤是Glu兴奋毒性损伤的主要途径，与海马区细胞DND密切相关6。三是Glu超常释放造成了主要是海马区域内病理性的LTP，并有可能造成了以后的信息传递障碍形成学习记忆缺陷7。Glu和Asp是脑内含量最高、毒性最强的氨基酸，而NMDA受体在大脑皮层和海马、丘脑部位密度较高，这些区域恰是缺血易损区，因而Gl

13、u、Asp在缺血损伤中具有极其重要的作用。本模型的研究表明，反复脑缺血再灌后50min,模型组脑内Glu、Asp水平仍显著高于对照组，应用抗呆合剂进行防护，可明显减低脑内Glu、Asp的含量，从而对其所介导的兴奋毒性起到了抑制作用。抗呆合剂对抗兴奋毒性的机理可能有如下几点：我们所选择的测定Glu含量时间点是再灌注50min，此时Glu正处于恢复过程中，抗呆合剂的作用之一可能是促进Glu的重摄取，减少组织内Glu含量和作用时间；抗呆合剂的作用也有可能是减低了Glu释放的峰值量，从而在再灌50min时，Glu已经恢复至接近正常水平；直接对抗Glu的兴奋毒性，我室在培养神经细胞模型中已经证实8，抗呆

14、合剂的主要成分之一天麻毒，可明显减轻谷氨酸引起的神经元损害，保持神经细胞膜的完整性和形态结构。总之，抗呆合剂缺血保护作用与Glu有直接的关系。至于药物作用的具体环节如：释放、重摄取、受体环节，尚待进一步研究。GABA是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，其作用需要经过GABA受体方式。缺血时GABA脑内释放量也升高。Westerhberg研究表明，GABA受体的缺血耐受性低于谷氨酸受体，因而脑缺血到一定程度时，GABA受体功能受损，增加的GABA并不能对抗兴奋性氨基酸引起的神经功能损害9。本实验结果也说明，缺血再灌50min时，GABA含量仍高于对照组，而抗呆合剂大剂量组的GABA含量低于模型

15、组，与对照组持平，说明抗呆合剂的应用使得造模后脑内氨基酸的变化情况与对照组相一致，从而维持兴奋/抑制氨基酸的相对平衡，稳定了脑组织内的生理状态。尼莫地平是二氢吡啶类钙通道阻滞剂，有研究表明它可以改善缺血区脑血流，抑制Ca2+内流，从而保护缺血脑组织10，但尚未见到对Glu作用的报道。我们的实验表明，尼莫地平对Glu释放的增加无抑制作用，它的保护缺血损伤的作用与Glu无关，而主要在于抑制Glu介导的Ca2+超载。3.2抗呆合剂调节脑内AchE活性作用Ach是脑内的经典神经递质，与认知、学习、记忆等大脑高级神经功能有关。学习记忆任务的完成伴随着脑内Ach的变化11。AchE是Ach的分解酶，它的活

16、力变化可间接反映脑内Ach含量和代谢情况。对于缺血后学习记忆障碍与Ach含量的关系，目前尚未有统一的认识，各家说法不一12。据文献资料，脑内功能状态不同，Ach和AchE变化也不一致，即使在正常个体也是如此11；本课题显示，缺血再灌后50min及7d，脑内AchE活力降低，而抗呆合剂和尼莫地平均可对抗这种变化，AchE活力接近于对照组。显示了脑缺血伴随着AchE活力的变化，抗呆合剂通过调节脑内AchE的活力影响了脑内的Ach，从而对缺血后的脑功能恢复产生影响，改善学习记忆障碍。*国家中医药管理局资助课题(No.95B111)作者简介：唐一鹏，男，58岁，研究员，医学博士生导师作者单位：北京中医药大学中西医结合研究所北京100029参考文献.脑血管疾病分册，1997，5(2)：969911Nagahara A.H, Brioni J.D, McGaugh J.L. Effects of intraseptal infusion of muscimol on inhibitory avoida