表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建

1、中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy, 2008, 28(10 :1217研究报告表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建3张 洋 刘春平 李 元33(中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所 北京 100050摘要 表皮生长因子受体 (ep ider gr 属受体酪氨酸激酶 (tyr osine kinase, TK 家族 , 。许多肿瘤的发生 、 。因此 , EGFR 胞内酪氨酸激酶的抑 。从人脐静脉内皮细胞 (HUVEC 提取总 RNA , 采用 RT 2PCR 获得 EGFR 酪氨酸激酶催化域的编码基因 。 将其克隆至载体 pET

2、230a, 在 E . coli BL21(DE3中进行了成功表达 , 采用 N i 2NT A 亲和层析对其进行了纯化 。通过对酶的活性的测定 , 证明重组 EGFR 酪氨酸激酶蛋白具有利用 ATP 催化底物发生磷酸化反应的激酶活性 。以该重组激酶为靶位构建了酶抑制剂筛选模型 , 拟对微生物代谢产物进行筛选 。 关键词 EGFR 酪氨酸激酶 克隆表达 重组蛋白 抑制剂筛选模型中图分类号 Q786收稿日期 :2008206224 修回日期 :2008208204 EGFR 广泛分布于哺乳动物的上皮细胞 、 人的成纤 维细胞 、 胶质细胞 、 角质细胞等 , 并在多种上皮肿瘤细 胞中过度表达1。

3、 EGFR 高表达的肿瘤患者 , 肿瘤恶性程度高 , 患者存活期短 2。人的 EGFR 基因定位于第 7号染色体的短臂 (7p12. 32p12. 1 , 它 的 编码 产 物由1210个氨基酸组成 , 是一种分子量约为 170kDa 的糖蛋白 , 由胞外结构域 、 跨膜区及胞内结构域组成3, 其中712979位氨基酸属于酪氨酸激酶区4。 EGFR 酪氨酸激酶能催化 ATP 的 磷酸基团转移至许多重要蛋白 质的酪氨酸残基上5, 使其发生磷酸化 , 进而导致信号的传导级联 。 据了解 50%以上的原癌基因和癌基因产 物都具有蛋白酪氨酸激酶活性 , 它们的异常表达导致 细胞增殖调节发生紊乱 , 进

4、而促使肿瘤发生 6。因此 ,以 EGFR 2TK 为靶位进行药物设计和筛选可能成为肿瘤治疗的有效途径之一 。 本研究将人源 EGFR 酪氨酸激酶催化域在 E. oliBL21(DE3 中成功进行了表达 , 采用 N i 2NT A 亲和层析对蛋白进行了纯化 , 并对重组蛋白的酪氨酸激酶活性 进行了优化条件研究 , 以其为靶点构建了酶抑制剂筛 选模型 , 对微生物产物进行筛选 , 为抗肿瘤新药的研制 奠定了一定基础。1 材料与方法1. 1 材 料1. 1. 1 质粒 、 菌株和细胞株 质粒 pET 230a 及大肠杆菌 BL21(DE3 由本室保存 , HUVEC 细胞由本所肿瘤室 保存。1.

5、1. 2 酶与主要试剂 限制性内切酶、 T4DNA 连接酶、 pfu DNA 聚合酶购自 Pr omega 或 TaKaRa 公司 ; 抗H is 2tag 的单克隆抗体 、 磷酸化的酪氨酸单克隆抗体购于 Santa crunz 公司 ; 山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的二 抗购自中山试剂公司 ; Hepes, 合成肽底物 poly (Glu,Tyr 4 1和 Na 3VO 4购自 Sigma 公司 ; TR I zol 为 I nvitrogen 2008, 28(10 张 洋 等 :表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建公司 产 品 ; NBT/BCI P 购 自 Pr o

6、mega 公 司 ; IPTG 购 自 MERCK 公 司。 UN I Q 210柱 式 DNA 胶 回 收 试 剂 盒 (Sangon 公司 。1. 2 方 法1. 2. 1 EGFR 2TK 基因的获得和重组质粒 pET 230a / EGFR 2TK 的构建 采用 TR Izol 试剂从人脐静脉内皮 细胞 (HUVEC 提取总 RNA 。采用两步法 RT 2PCR 试 剂盒 (TaKaRa , 以 O ligo (dT 2adap tor 为 RT 引物进行 反转录 , 反应条件为 :30 10m in, 42 30m in, 99 5m in, 10 5m in 。根据已知的 EGFR

7、 2TK 基因序列设 计引物 , 引物 1为 5 CAGG AG AGGG AGC TTGT 3 , 引物 2为 5 TT AGG AGTCTGT A GG ACTTGGC 3 (下划线分别为 Kpn I 和 in d点 。 采用上述引物 , , 按下述条件进行 2m 30s, 61 30s 和 72 1s, 30循环 ; 最后 72 延伸 4 m in 。 扩增的 EGFR 2TK 基因片段用 UN I Q 210柱式 DNA 胶回收试剂盒回收 , 以 Kpn I 2H in d III 双酶切该片段 , 克 隆至 Kpn I 2H in d III 酶切的 pET 230a, 转化至 E.

8、 coli BL21 (DE3 感受态细胞 , 从转化子 (Ka r 分离获得重组质粒 pET 230a /EGFR2TK, 酶切检定并进行序列测定 。 1. 2. 2 重组菌的诱导表达 将重组菌 E. coli BL21 pET 230a /EGFR 2TK接种至含卡那霉素 (25g/ml 的 LB 培养基中 , 37 培养过夜。按 1%的接种量转接到 含卡那霉素的新鲜 LB 培养基中 , 37 培养至 OD 600为0. 61. 0, 采用不同浓度 I PTG 和不同培养时间进行诱 导表达 , 以确定最佳诱导表达蛋白条件 。1. 2. 3 重组蛋白包含体的复性和纯化 (1 重组蛋白 的复性

9、 将上述菌 4 4000r/min 离心 10m in, 取菌体 悬浮于缓冲液 (50mmol/LTris 2HCl pH 8. 5, 5mmol/L EDT A , 150mmol/LNaCl, 1%Triton X 2100 , 置冰浴进行 超声波破碎 , 4 10000r/min 离心 10m in 弃上清 。将沉 淀用 包 含 体 洗 涤 液 (50mmol/LTris 2HCl pH 8. 5, 5mmol/LEDT A, 150mmol/LNaCl, 1%Trit on X 2100, 5mol/L尿素 洗涤后 , 4 10000r/min 离心 10m in 弃上 清 , 重复上

10、述步骤 2次 。按湿重 50m l/g 的比例将包含 体加至裂解液中 (50mmol/LTris 2HCl, pH8. 5, 5mmol/L EDT A , 150mmol /LNaCl, 3mol/L盐酸胍 , 200mmol/L2巯 基乙醇 。 室温放置过夜 , 包含体裂解后应澄清透 明 , 4 12000r/min 离心 15m in, 取上清液用预冷的复 性液 (20mmol/LTris 2HCl pH8. 5, 1mol/L盐 酸 胍 , 0. 5mmol/L还原型谷胱苷肽 , 0. 5mmol/L氧化型谷胱苷 肽 , 0. 5mol/L精氨酸 , 2mmol/LEDT A , 80

11、mmol/LNaCl 在 4 透析复性 48h 。 (2 重组蛋白的纯化 包含体复性后再以 B inding buffer (结合缓冲液、 300mmol/LNaCl , 50mmol/LNaH 2 PO 4, 10mmol/L咪唑 , pH 8. 0 充分透析 , 将 0. 45M 滤 膜过滤后的样品溶液上样至经结合缓冲液平衡过的 N i 2NT A 亲和层析柱 , 用 W ashing buffer (洗涤缓冲液、 300mmol/LNaCl , 50mmol/LNaH 2PO 4, 75mmol/L咪唑 , pH 8. 0 洗 涤 , 最 后 用 Eluting buffer (洗 脱

12、缓 冲 液、 300mmol/LNaCl , 50mmol/LNaH 2PO 4, 750mmol/L咪 唑 , pH 0 进行洗脱 , 进行 S DS 2 , 4 用蒸馏 , -20 保存 。2. 4 W estern 2blot 分析 样品进行 S DS 2PAGE 后 , 凝 胶置于转移缓冲液 (24mmol/LTris 碱 , 192mmol/L甘氨 酸 , 20%甲 醇 中 漂 洗 , 采 用 B i o 2Rad SE M I 2DRY TRANSFER 转膜仪进行蛋白印迹转移 , 根据凝胶面积 , 按 0. 65mA /cm 2, 2h, 经电转移将蛋白转至硝酸纤维素 膜 , 转

13、移毕用丽春红 S 溶液 (0. 1%丽春红 , 5%HAc 染 膜 , 以确定标准蛋白分子量条带位置 。将膜置入杂交 袋 , 加入 含 5%脱 脂 牛 奶 的 T BS 缓 冲 液 (50mmol/L Tris 2HCl pH 6. 0, 150mmol/LNaCl , 4 封闭过夜 。 用 T BS 2T (含 0. 5%Triton X 2100的 T BS 洗膜 3次 , 加入抗 H is 2tag 的单克隆抗体 (用含 5%脱脂牛奶的 T BS 1 1000稀释 , 室温缓振 2h, T BS 2T 漂洗 3次 , 加入碱性磷 酸酶标记的山羊抗小鼠多克隆抗体 (用含 5%脱脂牛 奶的

14、T BS 1 1000稀释 , 室温缓振 2h, T BS 2T 漂洗 3次 , 置于 NBT/BCIP 显色液中显色 , 室温下避光轻摇 , 待条 带清晰出现时 , 将膜取出放入蒸馏水中终止显色。 1. 2. 5 酪氨酸激酶活性测定 (EL I S A 法 7 在 96孔 板中包被酪氨酸激酶反应底物 poly (Glu, Tyr 4 13. 7g/孔 , 37 包被过夜。 用 P BS 洗板 3次 , 晾干。 在 90l TK buffer (50mmol/LHepes pH7. 4, 12. 5mmol/LMgCl 2, 0. 0625mmol/LMnCl 2, 0. 2mmol/LNa

15、3VO 4 中加入终浓度 为 12. 5mol/L的 ATP, 再加入 5l EGFR 2TK, 于 37 孵 育 1h 进行激酶反应。 分别用 P BS 2T 和 P BS 各洗板 3次 , 晾干。每孔加入 250l 含 3%牛血清白蛋白 (BS A 的 P BS 溶液在室温封闭 1h 。 分别用 P BS 2T 和 P BS 各洗板 3次 , 晾干。 每孔加入 100l 小鼠磷酸化酪氨酸的单克隆 抗体 (1 1000稀释 , 室温放置 2h 。 分别用 P BS 2T 和 P BS 各洗板 3次 , 晾干。每孔加入 100l 辣根过氧化物酶标 记的山羊抗小鼠 I gG (H +L 多克隆抗

16、体 (1 1000稀释 , 3 1中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy Vol . 28No . 102008室温放置 2h 。 分别用 P BS 2T 和 P BS 各洗板 3次 , 晾干。 每孔加入 T MB 和 H 2O 2各 50l, 室温放置 1h, 加入 100l 1mol/LHCl 终止反应 , 使用酶标比色计 (B io 2Rad model 680 在 450nm 检测样品光密度值 (OD 。 基于上述方法 , 对不同浓度 EGFR 2TK 酶、 底物 poly(Glu, Tyr 4:1、 ATP 、 Mg 2+及 Mn 2+对酶催化底物磷酸化反应的

17、影响进行了研究 。1. 2. 6 酪氨酸激酶抑制剂筛选模型的构建 根据上述酪氨酸激酶活性测定方法 , 构建酪氨酸激酶抑制剂 筛选模 型 。除 了 EGFR 2TK 加 量 为 5 l 并 同 时 加 入 10l 待筛选的微生物发酵产物外 , 其他操作步骤同前 。 为检验微生物发酵培养基是否干扰酶活性测定 , 加入 10l 空白发酵培养基进行了预实验。 2 结 果2. 1 EGFR 2TK 从转化子提取重组质粒 pET 230a /EGFR2TK, 采用Kpn I 2H in d III 双酶切该质粒 , 获得 946bp 的 DNA 片段 ,说明 EGFR 2TK 成功插入 pET 230a

18、载体中 (图 1 。 通过 核苷酸测序结果显示插入的 EGFR 2TK 与已知序列完 全一致 (GenBank Accessi on No . X00588。 图 1 重组质粒 pET30a /EGFR2TK 的酶切分析F i g . 1 Restr i cti on enzy m e ana lysis of reco m b i n an tpl a s m i d pET30a /EGFR2TK1:DNA Marker; 2:pET 230a /EGFR 2TK; 3:pET 230a /EGFR2TKdigested by Kpn I 2H in d III ; 4:pET 230a

19、/EGFR2TK digested by Kpn I ;5:pET 230a /EGFR2TK digested by H in d III2. 2 重组 EGFR 2TK 蛋白的表达及蛋白复性纯化 采用不同浓度、 不同时间的 IPTG 对重组菌株 E.coli BL21pET 230a /EGFR 2TK 诱 导 表 达 , 通 过 S DS 2PAGE 结果分析表明重组蛋白在 OD 600为 0. 61. 0, 0. 05mmol/LIPTG 诱 导 下 , 37培 养 5h 表 达 重 组 EGFR 2TK 最佳 。 S DS 2P AGE 分析超声波破碎液的上清和沉淀 (图2 , 结果

20、表明重组蛋白主要以包含体的形式存在 , 分子量约为 40kDa 与预期值相符。重组 EGFR 2TK 蛋白包 含体采用前述方法复性后 , 用 N i 2NT A 亲和柱层析进行 纯化 , 结果如图 3所示。2. 3 W estern 2blot 分析 采用抗 H is 2tag 的单克隆抗体对纯化的重组 EGFR 2TK 进行 W estern bl ot 杂 交 , 结 果 显 示 重 组 蛋 白 在 约 40kDa 处出现单一杂交带 , 这表明重组 EGFR 2TK 已在大肠杆菌表达 , 因蛋白具有 H is 2tag 标签 , 因此能与抗H is 2tag 的单克隆抗体结合 (图 4 。

21、41 2008, 28(10张 洋 等 :表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建 图 4 重组 EGFR 2TK 蛋白的 W estern 印迹分析F i g. 4 W estern 2blotti n g ana lysis forreco m b i n an t EGFR 2TK1:Molecularweight marker; 2:E . coli BL21pET 230a /EGFR2TK2. 4 测定重组 EGFR 2TK 的酪氨酸激酶活性 对重组 EGFR 2TK 进行酪氨酸激酶活性测定 , 结果 表明不同浓度的 EGFR 2TK 在 ATP 存在的条件下

22、, 能使 底物 poly (Glu, Tyr 4 1的酪氨酸发生磷酸化反应 , 其活 性呈剂量效应 , 当 EGFR 2TK 酶量达到 5l /孔时酪氨酸 激酶活性最高 (图 5A , 然后曲线呈平直状。 为了优化重组 EGFR 2TK 酪氨酸激酶活性的测定条件、 分别 对 不 同浓 度 底 物 poly (Glu, Tyr 4 1、ATP 、 Mg 2+及 Mn 2+对酶活性影响进行了研究 , 结果表明 poly (Glu, Tyr 4 1的最适浓度为 725g/孔 (图 5B , ATP 12. 5C , Mg 2+的最佳浓度 2度 为 0. 0625mmol/L ( 图 5 不同浓度激酶

23、 (A 、 多肽底物 (B 、 ATP(C 、 M g 2+浓度 (D和 Mn 2+(E 对重组 EGFR 2TK 激酶催化反应的影响F i g . 5 Effects of concen tra ti on s of the enzy m e(A , ATP(B , poly (Glu, Tyr 4 1(C , M g2+(D andM n2+(E on the enzy ma ti c reacti on ca t a lyz i n g by the reco m b i n an t EGFR 2TK2. 5 EGFR 2TK 酶抑制剂筛选模型的构建 利用上述方法构建的 EGFR 2T

24、K 抑制剂筛选模型 , 已对 200余株微生物发酵产物进行了筛选 , 根据抑制 率大于 50%确定阳性结果 , 目前筛选仍在进行中 。同时结果还显示微生物空白培养基对活性测定无干扰 。3 讨 论 EGFR 是一种跨膜受体 , 存在至少 5种不同的配51 中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy Vol . 28No . 102008基 , 其中包括 EGF 和 TGF 2, 在细胞生长调节和分化中 起重要作用 8。 70%以上生长的肿瘤细胞存在该受体 及其配基 , 其过度表达或调节障碍会改变胞内信号途 径 , 以不同方式影响肿瘤细胞的存活及凋亡 , 因此该受 体可作为肿瘤

25、治疗的靶点 9, 以其为靶位国外已有 8种小分子抑制剂上市 10。 EGFR 胞内结构域的羧基端含有主要的自磷酸化 位点 11, 当其配基 EGF 、 TGF 2等与 EGFR 胞外域结合 后 , 胞内的 EGFR 2TK 被激活 , 既可以使其羧基端的自 磷酸化位点磷酸化 , 同时也催化胞内其他底物蛋白的 磷酸化 , 从 而 引起 信 号的 传 导 。本研 究 在大 肠 杆菌 BL21中克隆表达了 EGFR 酪氨酸激酶结构域 , 该部位 不存在自磷酸化位点 , 因此表达的重组 2TK 磷酸化蛋白 ,但是在 ATP poly (Glu, Tyr 4 1, , 因 此可以用于构建 EGFR 2T

26、K 抑制剂的筛选模型 。 研究表明获得的重组 EGFR 2TK 存在 Mn 2+结合位 点 ,Mn 2+可以通过使重组的 EGFR 2TK 蛋白构象发生改 变而调节激酶的活性 12, 13,Mg 2+对 EGFR 2TK 催化活性 的影响较 Mn 2+弱 , 只有存在 EGF 等生长因子刺激的情 况下才能有效提高 EGFR 2TK 的活性 。因此本研究采 用不同浓度的 Mn 2+、 Mg 2+对 EGFR 2TK 的影响进行了 分析 , 结果表明 0. 0625mmol /L的 Mn 2+即使酶催化活 性达最大值 , 而 Mg 2+所需浓度为 12. 5mmol/L,与文献 分析结果一致 12

27、。 目前研究 EGFR 2TK 的抑制剂的主要途径之一 , 是 作用于 EGFR 胞内区干扰 ATP 结合的小分子化合物 。 在 EGFR 2TK 的 催 化 结 构 域 中 存 在 ATP 的 结 合 位 点 14, 其抑制剂可以通过竞争性抑制 ATP 与 EGFR 2TK 的结合 , 从而阻止 EGFR 2TK 的激活和下游信号的传 导 15。 基于以上机理 , 本文以重组 EGFR 酪氨酸激酶 为靶位 , 构建了酶抑制剂筛选模型 , 拟从微生物产物中 筛选 EGFR 2TK 的抑制剂 。为了进一步验证模型的有 效性 , 我们拟采用已知 EGFR 2TK 的抑制剂作为阳性对 照 , 目前尚

28、在寻求中。 与目前国内外研究者主要采用 A431细胞 (人表 皮鳞状细胞癌细胞 7、 sf916昆虫细胞等真核细胞表 达 EGFR 2TK 催化域的筛选模型相比较 , 以大肠杆菌表 达的 EGFR 2TK 构建模型较方便易行。参考文献 1Scagli otti G V, Selvaggi G, Novell o S, et al . The bi ol ogy ofep ider mal gr owth fact or recep t or in lung cancer . Clinical Cancer Research, 2004, 10:42274232 2Harari P M. Ep

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