第四章 DNA的分离、合成与测序

1、第四章 DNA的分离、合成与测序 一、填空题 1不同的宿主细胞其核酸酶的活性是不同的，如细菌中的HBl01菌株及JM系列的宿 主菌所含核酸酶的活性比DHl、LE392等菌株-。 2SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： (1)-一； (2)-一； (3)-； (4)-一; 3酚是蛋白变性剂，用酚抽提细胞DNA时，具有两方面的作用：(1)- 2)-一。 4用酚氯仿抽提DNA时，通常要在氯仿或酚氯仿中加少许异戊醇。这是因为：异戊醇-一。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 5同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K具有两个显

2、著的优点：(1)- (2)-。 6在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 7用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是-。 8 浓缩DNA的方法有：(1)-(2)-(3)(4)-。 9通常可在三种温度下保存DNA：45、-20、70，其中以最好。 10.用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到08X109细胞ml时，即可通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以-为宜。 11引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1)-(2)-3)-(4)-。 12Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末

3、端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的-。 13在用SDS分离DNA时，要注意SDS的浓度，01和1的SDS的作用效果是不同的，前者-，后者-。 14碱解法和清亮裂解法是分离质粒的两种常用的方法，二者的原理是不同的，前者是根据-，后者则是根据-。 15在DNA分离过程中，通常要进行透析，其目的是-。 16在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：(1)-(2)-。 17，在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素很多，主要有(1)- (2)-(3)-。 18在分离DNA时，常用-法、-法、法及-法等方法去除蛋白质。 19在DNA保存液中，常

4、加一滴氯仿，主要是起-作用。 20按照人们的意愿，改变基因中碱基的组成，以达到-的技术称为-。 211955年，英国剑桥大学的第一个合成了具有3，5磷酸二酯键的TpT和pTpT为此获得了-年的诺贝尔奖。 22可以用-除去DNA溶液中的氯化铯。 23在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在-. 24在简并引物的设计中，常常要用到dI(次黄嘌呤)，原因是- 25在分离DNA时，要戴手套操作，原因是-。 26乙醇沉淀DNA的原理是-。 27简并引物PCR主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计引物来合成相应的基因。 28超离心法纯化质粒DNA时， 选用CsCl作介质的优点是： (1)-一 (2)-

5、，从而使不同分子量的DNA分子得以分开。 29缺失突变的原理是缺失了-一 30用核酸酶Bal31作系列缺失突变，得到的产物是：-. 31SSC是由NaCl和柠檬酸钠组成的试剂，其中NaCl的作用是使-，而柠檬酸钠的作用是一-。 32在重蒸酚中加入01的8羟基喹啉及少量巯基乙醇，不仅可以防止酚的氧化还可以-的活性及-作用。 33对于HBl01及其衍生株不宜用煮沸法分离质粒DNA，其原因是-. 二、判断题 1氯霉素扩增DNA时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。 2所谓引物就是同DNA互补的一小段RNA分子。 3脉冲凝胶电泳采用一个很强的电场来分离非

6、常长的DNA分子，其原理在于迫使DNA分子根据长度的不同而具有不同的速度，并按大小顺序通过凝胶. 4. Agarose-EB电泳法分离纯化CCC DNA原理是根据EB可以较多地插入到CCC DNA中，因而迁移速度较快。 5如果PCR的每一次循环都把上一次循环中合成的DNA都加了一倍，那么，10个循环就扩增了1000倍，20个循环就扩增了100万倍，30个循环就扩增了10亿倍. 6PCR既能用于扩增任何天然存在的核苷酸序列，又能重新设计任何天然核苷酸序列的两个末端。 因此，任意两个天然存在的DNA序列都能快速有效的扩增，并拼接在一起。 7最有效的制备纯RNA的方法是让其在细胞中超表达，然后提纯。

7、 8大量制备已被克隆基因编码蛋白产物的常用方法是体外转录和翻译。 9通过报告基因与来自于目的基因上游和下游各种DNA片段的结合，研究基因的调控序列. 10温度敏感突变型是非常有用的，在这些突变型中，可以通过对温度的改变控制这些突变体中异常表型的出现。 11用人工合成的含有所需碱基变化的寡聚核苷酸，可以将特殊突变引入克隆的基因。 12蛋白质的氨基酸序列中各种重要信号都可以通过短氨基酸序列同报告蛋白的融合进行研究. 13简并引物是根据已知DNA序列设计的引物群. 14在DNA贮存液中加一滴三氯甲烷，可防止真菌的污染。 15密码的偏爱性是指不同种属的生物对简并密码具有不同的使用频率。 16插入到质粒

8、DNA中的EB可以用正丁醇抽提除去。 17碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不相同的。 18酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。 三、选择题(单选或多选) 1从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖溶液，目的是：( ) (a)抑制核酸酶的活性 (b)保护DNA，防止断裂 (c)加速蛋白质变性 (d)有利于细胞破碎 2不是所有松弛型质粒都需要进行扩增的，如pBS、pUC载体系统就不必进行氯霉素扩增，这是因为这些质粒的拷贝数很高，达到( ) (a)3050 (b)100200 (c)300400 (d)500700 3在亚磷酰胺化学法合成DNA中，影响产量的最关键步骤

9、是：( ) (a)脱三苯甲基反应 (b)偶联反应 (c)氧化反应 (d)封端反应 4有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法(Maxam-Gtbert)和酶学序列分析法(Sanger)。酶学测序法的基本原理优点是：( ) (a)碱基与特殊染料间不同的相互作用 (b)一个合成引物的延伸和DNA修复合成的可靠终止 (c)限制性位点与DNA末端标记的相关性 (d)可同时对DNA双螺旋的两条链进行测序 (e)反应是DNA特异的，RNA不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也节约了开支 5CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是：( ) (a)氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去 (b)氯

10、化铯可以较多地插入到SCDNA中去 (c)EB可以较多地插入到线状DNA中去 (d)EB可以较多地插入到SCDNA中去 6关于cDNA的最正确的提法是：( ) (a)同mRNA互补的单链DNA (b)同mRNA互补的双链DNA (c)以mRNA为模板合成的双链DNA (d)以上都正确 7在分离mRNA的溶液中，Mg2+离子的浓度不能低于05mmolL，因为低了，( ) (a)mRNA会降解 (b)mRNA会沉淀 (c)核糖体解体 (d)mRNA会变性 8用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：( ) (a)染色体DNA断成了碎片 (b)染色体DNA分子量大，而不能释放 (

11、c)染色体变性后来不及复性 (d)染色体未同蛋白质分开而沉淀 9下面哪一种特性不是密码所具有的? ( ) (a)偏爱性 (b)简并性 (c)重叠性 (d)连续性 10用SDS-酚来抽提DNA时，SDS的浓度是十分重要的，当SDS的浓度为01时，( ) (a)只能将DNA抽提到水相 (b)只能将RNA抽提到水相 (c)可将DNA、RNA一起抽提到水相 (d)DNA和RNA都不能进入水相 11关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确?( ) (a)溶液工的作用是悬浮菌体 (b)溶液的作用是使DNA变性 (c)溶液的作用是使DNA复性 (d)质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性

12、 12异戊醇的作用是：( ) (a)使蛋白质脱水 (b)使DNA进入水相 (c)帮助DNA进入水相 (d)减少气泡，促进分相 13松弛型质粒： ( ) (a)在寄主细胞中拷贝数较多 (b)可用氯霉素扩增 (c)一般没有选择标记 (d)只有(a)和(b)是正确的 14关于PCR扩增停滞的原因有很多种，但下列各项中，( )项不是主要原因。 (a)底物(模板)过剩 (b)dNTP的大量消耗 (c)产物的聚集 (d)非特异性产物的竞争性抑制 15Clark做了一个有趣的实验，发现Taq DNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的 末端加一个碱基，主要是加( ) (a)dGTP (b) dATP (c)

13、dCTP (d)dTTP 16在简并引物的3端尽量使用具有简并密码的氨基酸，这是因为( ) (a)Taq酶具有一定的不精确性 (b)便于排除错误碱基的掺人 (c)易于退火 (d)易于重组连接 17变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNA分离，原因主要是：( ) (a)氧化物可使DNA的磷酸二酯键断裂 (b)氧化物会改变pH值 (c)氧化物同DNA形成复合物 (d)氧化物在DNA分离后不易除去 四、简答题 1PCR反应包括引物与DNA模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物-DNA 双螺旋稳定性的影响及对PCR产率的影响。 2Sanger的双脱氧法测序的原理。 3分离DNA时，为什么要在缓

14、冲液中加入一定浓度的EDTA和蔗糖? 4PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? 5说明合成接头在基因工程中的主要作用。 6从细菌中分离总DNA，应采取哪些措施获得高分·子量的DNA? 7用酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是会停留在水相和酚相之间? 8分离pBR322 DNA可考虑用氯霉素扩增，分离pUCl8质粒DNA则不必用氯霉素扩增，为什么? 9溶菌酶是破碎细菌细胞的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理? 10假定你从黏质沙雷氏菌中克隆了一个基因，并推测可能是依赖于锌的金属蛋白酶，因为它含有两个组氨酸和一个谷氨酸与锌形成锌指

15、结构，请你设计个方案，改变其中一个组氨酸看看是否改变蛋白酶的活性？ 11你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出的引物中选出合适的一对。 5-GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG-3 3-CTGGACACCTTCGGTATGCCCTAAC-5 引物1 引物2 5'-GACCTGTGGAAGC 5-CATACGGGATTG 5-CTGGACACCTTCG 5-GTATGCCCTAAC 5'-CGAAGGTGTCCAG 5-GTTAGGGCATAC 5'-GCTTCCACAGGTC 5-CAATCCCGTATG 五、问答题1   用于克隆的DNA在质量上有什么要求?2   为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂？3   为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？4   为什么氧化变色的酚不能直接用于DNA的分离？5   在DNA的分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽