聚合酶链反应结合TaqⅠ酶切分析检测到一例凝血因子Ⅷ基因热点突变

1、    聚合酶链反应结合Taq 酶切分析 检测到一例凝血因子基因热点突变          我们介绍运用聚合酶链反应(PCR)结合限制性内切酶Taq 酶切分析方法研究凝血因子(F)基因热点突变，首次在国内发现1例血友病A基因热点突变，现报道如下。病例和方法1 病例资料 患者，男，3岁。平时有鼻衄、撞后出血不止等症状。1年前因唇外伤后出血不止来我院诊治。家族中无类似病病史。主要实验室检查：CT 10分钟，BT 6.5分钟，KPTT 93.2秒，FC

2、 2%(一期法)，FAg?%(放免法)。2 基因组DNA抽提  按本室常规抽提外周血白细胞基因组DNA。3 聚合酶链反应(PCR)3.1 引物：用于PCR扩增F基因24号外显子的引物序列为：pA7:5-TTGAGGTTGCAGCATGCCAT-3pA8:5-CTGAGGTCTCCAGGCATTAC-3以上引物由法国巴黎Bicetre医院Meyer教授惠赠。3.2 PCR：反应体积50l，DNA 0.5g，引物各25 pmol，dNTP 50mol/L，1.5mmol/L MgCl,10mmol/L Tris-Cl(pH 8.3), 50mmol/L KCl, 0.1% Triton

3、X-100, Taq DNA聚合酶1.5U(Sangon公司产品)。扩增条件：94预变性5分钟，94变性30秒，56退火30秒，74延伸30秒，共35个循环，最后74延伸7分钟。取10l上述PCR扩增产物作1.5%琼脂糖电泳，检查是否扩增出特异性条带。3.3 PCR产物酶切分析：见文献1，PCR扩增产物经氯仿-异戊醇(241)抽提，取20l以限制性内切酶Taq (Boehringer-Mannheim公司)10U，65酶切过夜。酶切产物作8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，1×TBE，电压120V，电泳3小时。电泳后置0.5%溴乙锭染色30分钟，置紫外灯下观察酶切谱。4 PCR扩增产

4、物的克隆  PCR扩增产物经补平、磷酸化，1.2%琼脂糖电泳纯化后，与克隆载体pUC18(经Sma酶切)在T DNA连接酶作用下连接，连接物常规转化大肠杆菌TG1，并在涂有X-gal和IPTG的LB平皿中接种，挑取白色菌落扩增，抽取质粒DNA，然后由EcoR、Hind 双酶切鉴定。5 DNA序列分析 采用Sanger双脱氧链终止法，按T Squencing试剂盒使用说明操作，-P dATP标记，6%变性聚丙烯酰胺凝胶，厚度为0.4mm，胶长50cm，电泳在Pharmacia LKB公司的Macrophor测序仪上进行，电压1500V，时间36小时。测序胶置X线片曝光，室温过夜，放射自

5、显影。结果1 血友病A F基因外显子24 Taq 酶切分析结果2 患者F基因第24号外显子DNA序列分析结果，发生了CT点突变讨论F基因DNA链上胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，形成一个终止密码子(TGA)，使F肽链合成提前终止，合成较短的没有功能的F。这通常与血友病A重型表型相关2。这种突变发生于CG双核苷酸。CT突变是基因突变的“热点”，其原理是胞嘧啶甲基化形成的5-甲基胞嘧啶自动经过脱氨作用形成胸腺嘧啶，结果引起DNA碱基CT突变。由于F基因及其cDNA较长，血友病A的发病机制相当复杂。在已发现的300多种基因缺陷中，点突变占174个(57%)，尤其是轻、中型患者，点突变是主要的发病机

6、制，其中热点突变占25%3。在F cDNA中，共有7个Taq酶切位点，其中5个为CGA密码子编码精氨酸(Arg)。如果发生CT突变，即导致终止密码子的产生，它们分别位于外显子18，22，23，24和26号。最初血友病A患者的基因突变就是利用Southern印迹技术结合Taq 酶切发现的。为此我们应用PCR结合Taq 酶切分析了72个血友病A病例F基因这5个外显子Taq酶切位点的基因突变情况，结果发现1例异常，在24号外显子处丧失1个Taq 酶切位点。经克隆测序证实，该患者F基因24号外显子2209位密码子发生突变，即CGATGA，使精氨酸变成终止密码子。据国外文献报道，发生在Taq 位点的基因

7、突变频率大约占所有血友病A患者的3%6%，而我们的频率约为1.4%，这种差异还有待于扩大研究样本来进一步证实。国外已报道的该位点突变的24例血友病A患者中12例为精氨酸突变为谷氨酰胺，10例为精氨酸突变为终止密码子，而且绝大多数为重型病例。运用PCR扩增包含Taq 酶切位点(识别CG序列)区域，这对于血友病A基因缺陷的快速筛选不失为一种有效的定位方法。反过来，这些位点的突变也为CG双核苷酸热点突变提供了佐证。F基因热点突变的研究，不仅有助于了解这些位点的基因突变频率，而且也有利于开展快速的遗传咨询工作。作者单位：215006   苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所、苏州医学院血

8、栓与止血研究室参 考 文 献1 Lavergne JM, Bahnak BR, Vidaud M, et al. A directed search for mutations in hemophilia A using restriction enzyme analysis and denaturing gradient gel electrophoresis: a study of seven exons in the factor gene of 170 cases. Nouv Rev Fr Hematol, 1992, 34:85-91.2 Pattinson JK,Millar DS

9、,McVey JH,et al.The molecular genetic analysis of hemophilia A: a directed search strategy for the detection of point mutations in the human factor gene. Blood, 1990，76:2242-2248.3 Tuddenham EGD, Schwaab R, Seehafer J, et al. Haemo-philia A: database of nucleotide substitutions, deletions, insertion

10、s and rearrangements of the factor gene. Nucl Acids Res, 1994, 22:3511.4 Gitschier J, Kogan S, Levinson B, et al. Mutations of factor cleavage sites in hemophilia A. Blood, 1988, 72:1022-1028.5 Gitschier J, Wood WI, Tuddenham EGD, et al. Detection and sequence of mutations in the factor gene of haem

11、ophiliacs. Nature, 1985, 315:427-430.6 Antonarakis SE, Waber PG, Kittur SD, et al. Hemophilia A: detection of molecular defects and carrier by DNA analysis. N Engl J Med, 1985, 313:842-848.7 Youssoufian H, Antonarakis SE, Aronis S, et al. Characterization of five partial deletions of the factor gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:3772-3776.8 Youssoufian H, Antonarakis SE， Bell W, et