载多肽和蛋白质药物的纳米粒给药系统的研究进展

1、    载多肽和蛋白质药物的纳米粒给药系统的研究进展        摘要：目的综述近几年在输送多肽和蛋白质药物的纳米粒给药系统方面的研究进展。方法分析有关文献资料，从纳米粒给药系统的载体材料选择、制备方法、体外释药及应用等方面进行了概述。结果纳米粒给药系统可有效延长多肽和蛋白质药物的释放，同时可提高此类药物的生物利用度。结论纳米粒给药系统在输送多肽和蛋白质药物方面有着广阔的研究和应用前景。关键词：多肽；蛋白质；纳米粒给药系统中分类号：R94文献标识码：A文章编号：1001-2

2、494(2000)07-0437-04近年来, 随着基因工程及生物技术的发展, 出现了许多用于预防和治疗疾病的多肽与蛋白质药物1。但由于多肽与蛋白质药物能迅速被胃肠道消化酶降解破坏，临床应用受到很大限制, 加之此类药物的生物半衰期普遍较短，故需频繁注射给药, 造成患者心理和身体的痛苦，即使皮下或肌内注射给药，低的生物利用度仍不可避免。另外, 由于多数多肽与蛋白质类药物具有较低的分配系数和很小的扩散性能，使得药物不易被亲脂性膜所摄取，很难通过生物屏障。许多学者尝试了对药物进行化学修饰、制成前体药物、应用吸收促进剂、使用酶抑制剂防止酶解、采用医学工程技术如离子电渗法增加药物透皮吸收及设计各种给药系

3、统解决上述问题。其中，纳米粒给药系统具有独特的药物保护作用及控制释放特性。而日益受到关注。本文对载多肽与蛋白质药物纳米粒给药系统研究中较重要的环节，如载体材料的选择、制备工艺及影响因素、体内外释放特性、体内过程及应用进行了综述。1载多肽与蛋白质药物纳米粒给药系统的制备1.1纳米粒定义及药物的特性纳米粒(nanoparticle)是粒径小于1m的聚合物胶体给药体系。按制备过程不同可分为纳米球(nanospheres) 和纳米囊(nanocapsules)。制备优良的纳米粒给药系统，首先必须要考虑多肽与蛋白质药物的特性，如化学结构、稳定性、生物半衰期、给药方式以及药动学和此类药物的生物节律性。其中

4、，稳定性由于受到纳米粒制备过程中诸如有机溶剂的使用、加热及超声方法的影响较突出，而改善其稳定性的方法主要包括：加入盐或电解质，以提高热稳定性和减少可逆变性；加入亲水高分子化合物如甘露糖、明胶、羧甲基纤维素钠等，可在药物表面形成水化层起到保护作用；加入磷脂类化合物；进行化学修饰提高多肽的热稳定性，延长体内半衰期23。1.2制备纳米粒载体材料的选择制备纳米粒的载体材料可分为生物降解型和非生物降解型两种。生物降解型包括：聚(-羟基酸)，如聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物和聚(羟基丁酸)等；交链聚酯，如聚丙交酯、聚(-己内酯) 及聚氰基丙烯酸烷基酯等；聚原酸酯；聚酐和多肽。非生物降解型包括：聚甲基

5、丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚酰胺等。因多肽与蛋白质的扩散速度非常慢，给药系统释放药物主要依赖载体聚合物材料的降解，而生物降解高分子材料在体内水解酶的作用下水解为单体，最终的产物为水及二氧化碳，避免了释完药物后通过手术取出载体材料的麻烦，故生物降解型载体材料应用日益广泛。众多学者对生物降解材料的化学水解降解机制做了研究，证实了酶催化降解的可能。1.3载药纳米粒的制备方法纳米粒给药系统的制备方法由于载体材料的不同而存在很大差异，Allemann等4对纳米粒制备方法及后处理方法做了系统的阐述，本综述就某些方法做必要的补充。Niwa等5采用W/O乳化-蒸发方法制备了载有亲水性多肽药物促黄体激素释放激素类似

6、物 (nafarelin acetate,NA)的纳米球，包封率较o/w法提高了数倍，其缺点是需要大量的油及有机溶剂。Maria等6设计了双乳化-溶剂蒸发法制备载有L-门冬酰胺酶(L-asparaginase)的纳米球，并采用超声乳化技术制得粒径200 nm左右的纳米粒,药物包封率达到40%。Niwa等7利用沉淀法制备了载NA的纳米球，制备中使用了二氯甲烷和丙酮的混合溶剂，聚合材料为丙交酯-乙交酯嵌段共聚物(PLGA)，得到粒径为200 nm左右、包封率为10的纳米粒，并讨论了通过加入磷脂类物质提高药物的包封率，虽有所改善，但是对亲水性药物包封不理想。沉淀法对包封亲脂性多肽与蛋白药物(如环孢素

7、A, cyclosporine A)具有独特的优势，操作简单，且粒径小，包封率高，具有重要的意义。另外，值得注意的是在亲水多肽-胰岛素(insulin)非注射给药研究中，以聚氰基丙烯酸异丁酯(PIBCA)为载体，采用界面缩聚技术，不仅包封率高，而且很好地保护药物，从而使这方面的研究得到更深入开展。纳米粒给药系统的制备方法多种多样，方法选择必须考虑药物与载体材料的性质，选取合适的溶剂或共溶剂及与之相适应的仪器，以达到最优组合。2载药纳米粒给药系统的体外释放研究研究纳米粒给药系统的体外释放，须考虑以下几个可能的机制：由于聚合物材料的融蚀或降解而释放药物。多肽与蛋白质类药物经孔洞自发扩散释放。药物从

8、聚合材料表面释放。由于波动磁场或声场的诱导而产生脉冲式释放。通常，以上机制同时存在。相比较而言，药物经孔洞自发扩散释放机制显得不太重要，因为多肽与蛋白质类药物如能轻易从由于相分离及药物溶解而造成的水性通道扩散出来，那么纳米粒系统的药物包封率就可能极低。实际上，聚合物表面的药物释放及聚合物材料降解而造成的药物释放是最重要的，这就是“爆释效应”(burst effect)常被观察到的原因。纳米粒释放多肽与蛋白质类药物的典型曲线可分为三相：起始突释相、扩散控释相和降解控释相。起始突释相是指位于粒子表面或近表面的蛋白质、多肽在几小时内快速释放; 扩散控释相是蛋白质通过粒子表面孔道扩散释放。为获得药物的

9、连续释放，扩散控释相必须与降解控释相重叠，聚合物降解形成的孔隙使包裹的蛋白质连续释放。国外学者研究了聚氰基丙烯酸烷酯 (PACA)纳米粒的体外释药特性，其所选模型药物为生长激素释放因子(GRF)。结果显示，GRF从纳米粒中的释放不是由于多肽从聚合物骨架中被动扩散引起的，而是因为聚合物骨架的不断生物融蚀造成的。实验还发现，药物的释放依赖于介质中酯酶的浓度，在鼠血浆中，由于酯酶浓度高,而使GRF的释放明显加快。另外，随着GRF的释放，实验介质的浊度随之下降,此现象可解释为：PACA的生物融蚀是由于聚合物的侧醚链经酯酶水解造成的，而水解结果是生成了水溶性的化合物，从而使体系的浊度下降；同样，因为聚合

10、物生物融蚀非常慢，造成体系浊度非常缓慢的下降以致药物释放时间大大延长,这些事实都可证明GRF的释放是由于聚合物的生物融蚀直接造成的。Tasset等8制备了载降钙素 (calcitonin) 的PIBCA纳米粒，用同样方法证实了上述结论。某些多肽与蛋白质类药物如胰岛素给药受体内生理环境影响，呈现周期性或波动性，因此需要一种脉冲式释药系统。有报道利用波动磁场来实现脉冲式释药，其基本原理为：在磁场存在下，由于磁力作用使聚合物链分离，导致大量的水渗透进入体系中溶解部分包封的胰岛素，并使聚合物骨架膨胀，增大了胰岛素的被动扩散；撤去磁场时, 在膨胀骨架中部分溶解的胰岛素，只能以经典扩散方式释放，从而达到了

11、控制药物释放的目的。另外，改变粒子表面的孔洞大小也可以调节药物的释放。有人研究了载多肽与蛋白质类药物的微粒 (粒径1m) 给药系统，并总结了多种制备方法并讨论了影响包封率、粒径及药物释放的因素，可作为纳米粒相关研究的良好借鉴，尤其是影响释药的因素及减小“爆释效应”的措施9。3纳米粒给药系统的体内研究及应用3.1纳米粒给药系统的体内靶向性纳米粒由于粒径小，进入体循环后主要被网状内皮系统( RES)中的白细胞、单核细胞以及巨噬细胞吞噬，而RES系统主要包括肝、脾和骨髓。载药纳米粒进入血管后，靶向作用于RES系统，这对于治疗RES系统疾病(如内脏利什曼病、细胞内感染)有特殊的意义。但多数疾病病因并不

12、在RES系统中，因此如何使纳米粒达到非RES系统的靶向给药,是近几年纳米粒靶向给药的研究重点。RES吞噬纳米粒的机制为：纳米粒进入循环后,被血浆调理素的蛋白吸附，调理素能吸附外来物质并加速RES对这些物质的吞噬，最主要的调理素为补体和免疫球蛋白。由于RES系统对这种调理素具有特异的识别能力，故吸附了调理素的纳米粒大部分被RES系统识别，并被具有吞噬功能的细胞所吞噬而达不到靶器官。根据文献报道4，采取相应措施减少RES系统对纳米粒的吞噬，延长体内循环时间的方法，主要集中在以下几方面：直接降低RES系统的摄取活性。有人使用聚苯乙烯纳米粒或用葡聚糖硫酸盐溶液对RES 系统进行抑制，结果虽较明显，但经

13、常对系统抑制则会损害其正常功能。高分子物质包裹纳米粒。常用的高分子物质有聚乙二醇(PEG)、混合磷脂、非离子表面活性剂、分泌物IgA及血清成分等，其主要目的是提高纳米粒表面的亲水性及降低纳米粒与调理素间的相互作用。研究结果证实，用PEG及非离子表面活性剂包衣的纳米粒被肝、脾摄取减少，延长纳米粒体内循环时间效果明显。体外磁性导向。有学者通过制备含磁性物质(Fe3O4)的载药纳米粒，并外加磁场来达到靶向给药。抗体包衣纳米粒。使用抗体包衣后不仅可延长循环时间， 而且可将纳米粒选择性地导向靶位。3.2纳米粒给药系统在输送多肽与蛋白质药物方面的应用3.2.1注射给药纳米粒经静脉给药可被RES系统快速吞噬

14、、消除，使得包裹的药物难以发挥正常药效，故这方面的研究重点是在于如何延长纳米粒的循环时间，以及如何保持药物活性。纳米粒经皮下及肌内注射给药可起到明显的缓释作用，并提高多肽、蛋白质类药物的生物利用度。Damge10 等报道载有胰岛素的生物降解PIBCA纳米囊，经皮下注射后，降血糖作用可持续24 h。Gautier11等进行了生物降解的聚氰基丙烯酸异己酯(PIHCA)包封GRF的体内研究，发现载GRF的纳米粒经皮下给药后较普通制剂出现的“爆释效应”明显减轻，且GRF的血浆水平持续24 h，缓释作用显著，AUC024结果比较(游离GRF为27 ng*min*ml-1,GRF纳米粒为505 ng*mi

15、n*ml-1)表明，纳米粒提高了此多肽药物的生物利用度，这是由于包封在纳米粒中的GRF避免了酶的大量降解，而游离GRF则无此保护，会很快在注射部位被代谢消除。载GRF的纳米粒体内缓释作用也可通过标记纳米粒的方式证实，即采用放射自显影技术，观察给药24 h后注射部位的纳米粒情况，采用上述技术也可证实经皮下注射的生物降解型聚合物是通过尿和粪便排泄的。Tasset等8同样证实了载降钙素的PIBCA纳米粒，经皮下注射后，达到明显的缓释释放药物的作用，同时提高了药物的生物利用度，值得注意的是，由于制备方法不同而得到的键合型药物载体纳米粒具有更好的延缓释放性能。3.2.2口服给药由于多肽与蛋白质类药物的特

16、殊理化性质，此类药物直接口服后效果很差，其主要原因为:胃中的酸催化降解。胃肠道中的消化酶作用。胃肠道粘膜的低通透性。通过吸收屏障后肝的首过作用。纳米粒作为多肽与蛋白质类药物的载体，经口服后主要通过小肠的Peyer's结而进入循环系统（主要是被Peyer's结中的M细胞摄取）;同时，由于纳米粒的粒径较小，可穿过肠系膜的细胞间通路进入循环。上述机制主要依赖于粒子的粒径、亲脂性、电荷及聚合物的组成。Damge等10用PACA制备胰岛素纳米囊，经糖尿病鼠口服给药后，第二天血糖下降50%60%，降血糖维持时间随胰岛素剂量加大而延长。但同样剂量的胰岛素纳米囊给正常鼠口服后并没有引起血糖下降

17、，主要是因为正常鼠体内具有自调节现象，但如何解释具有长期的降血糖效果时遇到了困难。Lowe等12也对载胰岛素的PIBCA纳米囊的口服吸收做了研究，并对纳米囊的小肠吸收机制及药物与纳米囊的作用方式等做了阐述，发现纳米囊并不能促进胰岛素的吸收，只不过起到部分保护的作用。同样，Bonduelle13等使用PIHCA为载体材料通过界面缩聚法制备环孢素A的纳米囊，包封率高达88，进一步的动物口服实验表明，此种给药系统能显著提高药物的生物利用度，并有效地减少肝和脾对药物的摄取，同时，使药物在肾脏中的分布减少，从而降低了环孢素A的肾毒性。载药纳米粒口服远没有达到人们的要求。一些学者试通过合用酶抑制剂(如抑肽

18、酶)，口服吸收促进剂(如胆酸盐)及表面活性剂(如普朗尼克F-68)等促进纳米粒的穿透作用，其结果有待进一步证实。值得注意的是，许多学者在研究肽类物质的口服吸收时，发现了经生物降解聚合物包封的免疫制品(如疫苗)口服后具有明显效果，使其倍受关注。总之，载多肽与蛋白质类药物的纳米粒口服给药研究虽已取得了很多宝贵的经验，但众多影响粒子吸收的因素还不清楚，小粒子透过粘膜的机制有待进一步证实，这些有碍于纳米粒口服给药的应用。3.2.3眼部给药由于眼的特殊构造、泪液的冲刷以及角膜皮层的亲脂结构，多数水溶液形式的滴眼液用后生物利用度差，其它的形式如眼膏及植入剂又使用不便和难以被患者接受，眼部给药长期困扰着人们

19、。因此，如何延长滴眼液在眼部停留的时间，提高药物的生物利用度，是相关研究的关键。国外学者研究了标记的聚己基丙烯酸烷酯(PHCA)纳米粒眼部给药后的组织分布。研究表明，由于纳米粒可与角膜和结膜表面活性粘附，从而延缓了被清除的速度，可在眼部停留较长时间。研究证实聚氰基丙烯酸丁酯( PBCA )纳米粒主要集中在眼部的内眼角及眼外区而不是角膜表面。研究发现PBCA 经角膜吸收后能引起细胞膜的破损，而使用聚(-己内酯)(PECL)为载体的纳米囊却无此缺点，且PECL 在盲管中聚集，从而延长药物的作用时间。基于上述的理论，Pilar等14制备了载环孢素A的PECL纳米囊，并对包封率、体外释放及影响因素、体

20、内的组织分布等做了较系统的研究，结果表明，不仅环孢素A的包封率很高(50%，药物/聚合物)，而更重要的是PECL纳米囊大大促进了环孢素A的穿透，使药物生物利用度显著提高，为研制新的眼部给药系统开辟新的途径。PECL纳米囊眼部给药系统在某些领域，如减小聚合材料的毒性、设计灭菌方法以及长期稳定性方面还要进行深入的研究。4结论与展望在过去20年中, 对纳米粒给药系统，特别是作为多肽与蛋白质药物输送的载体进行了广泛的研究。纳米粒的制备方法可选择性大，载体材料丰富，人们可以根据药物的特性，选择最佳的方法和最合适的材料以达到高的包封率及良好的体内、外释药过程。在纯化、灭菌及提高纳米粒制剂稳定性方面同样取得

21、了满意的结果。纳米粒作为输送多肽与蛋白质类药物的载体是令人兴奋的，这不仅因为纳米粒可改进许多肽类药物的药动学参数，而且在一定程度上可以有效地促进肽类药物穿透生物屏障。在纳米粒应用方面，最重要的仍然是通过包封药物来改进肽类药物的注射给药，已证实了经注射给药的纳米粒给药系统的可能性，但需注意RES系统的吞噬作用。虽然口服纳米粒后的吸收机制有待深入研究，且即使药物能透过胃肠粘膜屏障，进入循环系统的药物浓度极其有限, 但用纳米粒包封低扩散性的药物可提高其口服吸收的事实，表明了纳米粒口服给药仍具有研究价值。不可否认，大量数据证实纳米粒在口服输送抗原方面的巨大潜力。这主要取决于口服给药后, M细胞对粒子的

22、摄取特征及有限剂量的抗原即可获得足够免疫力的优势。纳米粒在其它方面的应用（如眼部）同样有发展前景。总之，纳米粒给药系统作为多肽与蛋白质类药物发展的工具有着广泛的应用前景，但最终的成功依靠医药工业的巨大发展：不断研制出新的药物及载体材料，不断开发它们的治疗潜力、安全性，探讨药物与载体材料的相互作用方式，而目前最重要的任务是阐明纳米粒的吸收机制和RES系统吞噬纳米粒的机制。马利敏（北京医科大学人民医院药剂科，北京100044）李玉珍（北京医科大学人民医院药剂科，北京100044）张强（北京医科大学药学院药剂研究室，北京100083）参考文献1王浩.多肽与蛋白质类药物给药系统的研究现状J.中国医药工

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