原核表达步骤总结

1、原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目 的基因已克隆到载体，并已转进入 JM109菌株中。一.鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌 JM109或BL21中大量表达（一）制样1 .挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于 700ul LB培养基，加入0.7ul Amp （100mg/mL），37°C200r/min 摇床培养，过夜活化。2. 以1: 50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中， 加入10uLAmp （100mg/ml），37°C200r/

2、min摇床扩大培养2h-3h,期间取样监控 菌液的OD值，控制菌液0D600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达 外源蛋白的生长状态。（一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌 的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间 ）3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK ），其余 7ml菌液加入7ul IPTG （储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。 以200r/min的转速，37oC摇床培养3h。4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。5. 加入1ml dH2

3、O,将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min， 倾倒上清。6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。（二）菌落 SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入 200ul 1 x SDS PAGE loading buffer（可根据沉淀的量 增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适）。用漩涡器剧烈震荡，确 保将管底沉淀震散。2. 将样品于100°C恒温加热器上开盖加热10min（ Marker也要加热）。样品凉 后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般 30ul40ul，marker 20ul。（三）SDS-PAG

4、E 分析1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶蛋白分子量 （kDa）凝胶浓度（）4-402012-451510-701215-1001025-2008分离胶（两块）配方15%12%8%ddH2O3.4ml4.9ml6.9ml30% Acr-Bis (29:1)7.5ml6.0ml4.0ml1.5M Tris-HCl ( pH8.8)3.8ml3.8ml3.8ml10%SDS150ul150ul150ul10%过硫酸铵150ul150ul150ulTEMED20ul20ul20ul总体积15ml15ml15ml按表中所列顺序从上到下加试剂， 加完TEME后,轻轻摇匀液体，一块胶加 7ml

5、溶液。加完后， 用ImLddHO封住分离胶液面，在室温（37C）凝结30min, 至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。2. 制作浓缩胶浓缩胶（两块）配方5%ddH2O3.4 mL30% Acr-Bis (29:1)0.85 mL1M Tris-HCl ( pH6.8)0.63 mL10%SDS50 uL10%过硫酸铵50 uLTEMED20 uL总体积5ml胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入 的深度，于室温（37Q凝胶30min。3. 胶凝好后，拔梳子，将胶放入电泳槽中，加入1XTris-Gly电泳缓冲液没过点 样孔，胶外侧

6、缓冲液界面应完全没过电极4. Marker点5uL，用10uL小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。电压打到70V，保证电流在20mA-30mA之间，当样品跑入浓缩胶时可适当调高 电压，但不宜多次调整电压，否则条带会跑歪。5. 当溴酚蓝电泳至胶槽底部时，一般需要2.5h，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部 分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min染色3h，可以过夜染色。6. 用移液器回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，倒入考马 斯亮蓝脱色液，40r/min脱色至胶背景透明，期间可每 2h更换一次脱色夜。根据菌落SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。二.鉴定目的

7、蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白1. 从冻存的菌液中取10ul，接种于5ml的LB培养基中，加入5ul Amp（100 mg/ml）,过夜活化菌株。2. 按照1: 50的比例，从活化的菌株中，取1ml菌液接种于50ml LB培养 基中，加入50ulAmp（100 mg/ml）,扩大培养3 h。3. 扩大培养后的菌液,取出10ml，不加IPTG,作为空白对照。剩余的40ml 菌液中加入40ul IPTG（0.5mol/l）,诱导蛋白表达。两者在37C, 200rpm 的条件下培养3h。4. 用50ml离心管收集菌体，8000rpm,离心3min。注意配平。5. 倒掉上清，加入40ml左右的dH2

8、O洗菌体一遍，12000 rpm,离心2min。 注意要将菌体充分打散。6倒掉上清，用枪头将上清吸干净。根据菌体的浓度，加入适量的PBSbuffer悬浮菌体。7. 用大功率的超声波将菌体破碎，其间超声波每工作2min,停止1min。菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白不易变性。如此反复6-10遍，直至菌液清澈。8. 12000rpm, 离心3min，分离上清和沉淀。9. 在沉淀中加入 250ul 1XSDS Loading buffer ,取 200ul 上清，加入 50 ul 5>SDS Loading buffer,在恒温加热器上 100C加热 10min。10. 加热后的

9、样品冷却到室温后，12000rpm,离心2min。11. 取上清40ul点样，按照一中的方法进行SDS-PAGE检测。点样顺序是： 对照的上清，沉淀，样品的上清，沉淀。12. 根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生。如果蛋白在沉淀中大量表达，则形成包涵体，需要改变诱导表 达条件，比如将扩大培养与诱导培养的温度改为25C,并延长相应培养时间。如果蛋白在上清中表达，则形成可溶性蛋白，可继续进行下一步 实验。纯化目的蛋白（整个过程要尽量保持在 4C进行）1. 大量诱导目的蛋白（一般需要 2-4 L的菌量），用超声波破碎细胞，收集 上清。2. GST纯化柱的柱床保存

10、在20%的乙醇中，使用之前，先用吸管将柱床轻 轻加入到柱子中，打开柱子，流出乙醇，使柱床沉积下来。3. 加入10ml PBS buffer,洗柱床3遍，使得柱床重新平衡。4. 将准备好的样品加入到柱子中，每次加入5-10ml样品，使样品结合在柱子上（每次上样量不能太多，因为柱子的结合能力有限）。5. 用PBS buffer洗柱子3遍，每次用10ml，去除柱子中非特异性结合的杂 蛋白。6. 加入5ml洗脱液（10m mol/l的还原型谷胱甘肽，用 50mmol/l tris-bufferr或者PBS buffer溶解）将目的蛋白洗脱出来。用1.5ml离心管收集流出 来的样品，每管接0.5ml样，

11、一共收集6-8管（一般情况，第一管流出 的是PBS第二和第三管大部分是目的蛋白，所以 OD值很大，第三至第 六管的OD值慢慢降低。不要偷懒一次接太多，不然会影响后续收集蛋 白。还原型谷胱甘肽很容易被氧化，如果一次没有用完，请用保鲜膜封 口置于4度冰箱保存，超过2天的话请更换新的洗脱液。）7. 用PBS buffer洗柱子1遍。8. 用分光光度计测每一管的 OD值，记录下读数，将读数大于 200的样品 留下（一般是第2至第4管），冻于-200冰箱中。9. 重复步骤4-8，直至所有样品均纯化完毕。10. 可以用SDS-PAGE检测纯化出来的样品浓度以及纯度。重生柱子的方法：(柱子使用三四次之后，需

12、要重生，即让柱子上的GST结合基团重新暴露出来)1 用还原型谷胱甘肽洗脱液洗柱子 3遍，每次加入10ml。2. 用PBS缓冲液洗柱子4遍，每次加入10ml。3. 用 50 mmol Tris HCl (pH 8.0)洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。4 .用0.5M NaCI ( pH 8.0)洗柱子3遍，每次加入10ml。5. 用100 mM醋酸钠(pH 4.5)洗柱子3遍，每次加入10ml。6. 用0.5M NaCL洗柱子3遍，每次加入10ml。柱子长时间不用，需要按照以下方式清洗及保存：1. 按照重生的1-6步骤先将柱子重生一遍。2. PBS洗柱子2遍，每次加入10ml。3. 将柱床用

13、吸管吸出，分别用 5%，10%，15%，20%的乙醇洗2遍。4. 用单蒸水轻轻冲洗柱子底部的膜，洗出杂蛋白。5. 柱床保存在含20%乙醇的PA瓶中。柱子和柱床置于4度冰箱保存。如果柱子用于纯化不同的蛋白，只需要按照重生方法的1,2步骤操作即可，然后直接纯化另外一个蛋白。如果柱子流速很慢，可能是柱子底部的膜被杂蛋 白堵住了。柱子重生之后，将柱床用吸管吸出，然后用单蒸水将柱子底部的膜 轻轻冲洗，再将柱床加入到柱子中，重新上样。如果柱子需要重生，请用完柱子的同学自觉完成这份工作，以免影响下一位 同学的使用。四.根据不同的用途浓缩蛋白1. 若蛋白用于制作抗体如果洗脱液用的是tris-bufferr配制

14、的，需要用1/4的PBS buffer进行 透析，然后在冷冻干燥机中冻干浓缩，因为公司最终需要将目的蛋白溶 于 PBS buffer 中。如果洗脱液是用PBS buffer配制的，则直接在冷冻干燥机中冻干浓 缩。GST纯化柱手册上建议的是用tris-bufferr配制洗脱液，但用 PBSbuffer配制的洗脱液可以将目的蛋白洗脱下来。可自己选用。2. 若蛋白用于活性检测由于蛋白在tris-bufferr和PBS buffer中，均能保持活性，所以不论用 哪种，都不需要透析，直接浓缩干燥即可。大肠杆菌IPTG诱导原核表达(2011-04-12 20:16:14)转载标签：分类：生物医药行业杂谈小

15、量表达1. 取单克隆菌落小养过夜2. 大养 50ml，至 OD600 达 0.4-0.63. 取 1ml 培养液，13000rpm , 1min 离心收集，30ul 水溶，加入 30ul 2XSDS loading buffer, - 20 保存4. 加入IPTG至1mM，每隔2hr重复步骤35. 配置相应的SDS- PAGE胶6. 将样在沸水中煮5min，上样10ul，60V跑浓缩胶，120V跑分离胶。7. 取胶，考马斯亮蓝染色30min，脱色液脱色过夜大量表达1. 前三步相同2. 加入IPTG 至1mM，培养6hr3. 4°C，8000rpm，离心 10min，去上清4. 用10

16、ml 1 XPBS重悬沉淀，加入溶菌酶 10mg，25C，30min5. 加入蛋白酶抑制剂 PMSF至终浓度为1mM6. 冰上超生破碎，200W，30S超声，30S间隔，30个循环7. 加入TritonX - 100,至终浓度为1 %，室温混合30min以提高融合蛋白的可浓性&4 C，12000rpm，离心10min，分别取上清，沉淀9. 上清，沉淀同时跑电泳，观察蛋白是在上清还是沉淀中包涵体中蛋白的纯化1. 将离心收集的菌体用包涵体蛋白纯化缓冲液洗涤一次2. 用1/50菌液的上述缓冲液悬浮菌体，按每1ml加入1mg溶菌酶，于25C水浴30min3. 加入PMSF至1mM，800W超生破碎菌10min4. 剪切菌体DNA5. 5000rpm， 4C， 10min 离心，去上清6. 25ml上述缓冲液洗涤沉淀 3次7. 用上述缓冲液悬浮至终浓度为0.5mg/ml& 悬浮蛋白溶液装入透析袋，于50倍体积透析液I中透析，4 C， 10hr9. 换100倍体积透析液II进行透析，4C，10hr10. 换100倍体积透析液III进行透析，4C，10hr11. 换100倍体积透析液IV进行透析，4 C，10hr12. 吸岀透析后的蛋白，稍离心除去丝状不溶物，分光光度计测蛋白浓度His6 标记蛋白过 NTA 柱纯化1.将Ni + NTA填料从4°C取出，与乙醇