运动疲惫对大鼠海马和纹状体ＢＤＮＦ、ＧＦＡＰ蛋白表达的诱导作用-大鼠纹状体定位图

1、运动疲惫对大鼠海马和纹状体、蛋白表达的诱导作用:大鼠纹状体定位图 摘 要：目的 观看运动疲惫对大鼠海马和纹状体脑源性神经养分因子(bdnf)及胶质纤维酸性蛋白(gfap)表达的影响，探讨运动疲惫产生的神经生物学机制。方法：选取24只sd大鼠随机分为对比组（cg）和试验组（eg），分别在运动后0,12,24 h将大鼠麻醉，灌注制备脑石蜡切片，采纳免疫组化染色法观看并分析海马和纹状体bdnf、gfap表达水平的改变。结果eg海马锥体细胞排列紊乱疏松，部分细胞出现固缩、肿胀和碎裂；gfap阳性细胞胞体增大，突起分支增多、增粗，着色加深。海马和纹状体12eg、24eg组bdnf阳性表达显著高于cg（p

2、1。在游泳训练期间对动物运动力量及活动状态进行行为学观看和记录，并结合体重、肌酸激酶(ck)和血尿素(bu)等指标的改变推断疲惫的程度。对比组动物相同条件常规饲养，不参与游泳训练。 1.3 组织切片与染色1.3.1 样本制备与切片 10 d的游泳训练结束后，分别在0、12、24 h用25%乌拉坦和0.9%乌巴比妥钠混合液以0.4 ml/kg剂量麻醉大鼠，腹主动脉取血测定ck和bu的含量；然后从左心室至升主动脉插管，用生理盐水快速灌注冲洗，4%多聚甲醛磷酸缓冲液（用0.1mpb配置，ph7.2-7.4）100 ml灌注、取脑、固定1012 h后行常规石蜡切片，片厚6m 。1.3.2 免疫组化染色

3、 选取海马和纹状体断面完整的切片，采纳免疫组织化学染色法（sabc）分别进行bdnf、gfap免疫组织化学染色：1）室温下将切片经下行梯度酒精脱蜡至水，入1% h2o2（甲醇配置）浸渍30 min以消退内源性过氧化物酶；2）蛋白酶k消化，3730分钟；3）10%正常羊血清封闭，3730 min；（4）一抗孵育，4过夜。一抗为兔抗bdnf（1：100，santa cruz）、兔抗gfap（1：800，zymed）；（5）s-a/hrp工作液（zymed）372 h；（6）dab 显色（0.05%dab/0.01% h2o2，0.01mpbs）510 min，常规脱水、透明、封片。以上除10%正常

4、羊血清封闭后挺直入一抗外，其余各步骤间均用0.01mpbs（ph7.2）漂洗3次，每次5分钟。阴性对比省去一抗，用0.01mpbs代替。 1.4 数据处理 从各组相同层面的连续切片中选取3张切片，在每张切片的海马、纹状体各选取3个视野，用cmias8真彩色病理图象分析系统（中国航空航天高校图象分析中心）猎取每个视野的平均面密度值(area density)和完密度值(optical density)。用spss10.0统计软件对全部试验数据进行单因素方差分析（one-way anova）和多重比较。 2 试验结果2.1 大鼠行为学、体重、ck和bu的改变 各eg大鼠在适应性游泳期间活泼好动，能

5、通过大幅抖动快速甩干皮毛上的水；但随运动天数及运动量的增长，出现神情倦怠，皮毛蓬乱枯槁，食欲降低，体型瘦弱，对外界刺激反应迟钝等一系列疲惫症状。试验期间cg大鼠体重自然增长，增长率为8.27%；而eg大鼠体重较运动前降低9.33%；统计学检验显示两组间体重改变均存在显著差异(p2。能够转变神经元的形态、维持多类神经元的存活、促进树突和轴突的生长及增加突触的可塑性3。已有讨论发觉，机体在各种应激作用后可引起神经细胞排列层次破坏，分布散乱稀疏，树突萎缩、且与邻周细胞脱离，细胞形态转变、内质网扩张、线粒体肿胀、中枢神经元脆弱性增加及细胞数量明显削减，尤其是海马ca3区神经元改变较为明显4。满君等的讨

6、论也发觉，运动后固缩神经元的bdnf表达增加5。本试验观看到大鼠游泳运动后，神经细胞出现固缩等形态学损伤的改变，海马和纹状体区神经细胞bdnf的表达水平上调，尤其以海马表现突出。我们的结果与上述讨论结果具有全都性。bdnf的高表达可能是机体在大运动量训练时避开神经元过度损伤的一种自我爱护性反应。通常海马神经元bdnfmrna 的表达由谷氨酸(glu)和gaba调控，glu的非nmda受体参加介导海马区神经元bdnf表达与释放的调整，且bdnf受体trkbmrna与谷氨酸脱羧酶共存6。高glu的存在可诱导存活神经元bdnf的高表达，从而促进损伤神经元的修复与再生。有试验证明，在应激前及应激早期经

7、海马ca3区赐予bdnf，改善了因应激引起的海马神经元组织学改变，可见bdnf对应激引起的神经元损伤具有养分和爱护作用。3.2 运动疲惫对gfap表达的影响 星形胶质细胞是脑内数量极其浩大的一类细胞。由于它与神经元紧密相邻, 几乎填充了神经元及其突起之间的全部空隙，所以始终被认为是中枢神经系统的主要支持成分，对神经元起养分爱护作用。近年来，随着神经科学讨论技术的不断进步，人们对该细胞有了更深化的了解和熟悉。发觉它在神经系统的正常生理活动、脑发育及神经病理过程中也起重要作用。gfap早已被证明是星形细胞的一种特异性分子标记物，gfap表达的强弱可反映星形胶质细胞的功能状态。不同应激源导致的神经细

8、胞损伤引起星形胶质细胞增殖、胞体和核肿大及受损部位gfap基因表达的转变，被认为是星形细胞对脑内任何损害的一种特异反应7。本试验讨论发觉，cg大鼠只有少数神经细胞出现gfap阳性表达，且细胞体瘦小，突起纤细。而运动疲惫大鼠海马和纹状体区的星形胶质细胞出现胞体增大和突起增粗的形态学改变特征，并有广泛区域性的gfap阳性表达，以24eg组为最明显。这与损伤后脑组织glu上升的趋势全都。在神经元和胶质细胞之间存在递质代谢循环，glu经神经末稍释放后，星形细胞对其部分摄取，并转化成谷氨酰胺排出，谷氨酰胺被神经元摄取后可重新合成所需物质，所以星形细胞是glu代谢的关键场所。运动应激或脑损伤后引起glu明

9、显上升，使星形细胞处于活化状态，物质交换功能活跃，以爱护神经元免受glu毒性的损害8。此外，星形细胞还被认为是脑内“免疫调整细胞”，能合成和分泌20余种细胞因子，主要是神经养分因子，如bdnf、ngf等。在损伤等刺激因素的作用下，活化状态的星形细胞可以调整这些爱护性和修复性的神经生长因子分泌，对神经细胞发育和再生起重要作用。本试验结果发觉，长时间力竭运动后疲惫大鼠海马和纹状体区神经元gfap阳性表达水平显著上调，使星形胶质细胞处于活化状态，加速了bdnf的合成和分泌。这一结果也证明运动疲惫诱导bdnf的高表达与星形胶质细胞的免疫调整作用有关。3.3 神经养分因子与神经元电活动的关系 trkb是

10、bdnf的特异性受体，bdnf与trkb结合引起突触素i磷酸化，增加可释放突触囊泡数量9。bdnf通过对特异性nmda受体亚单位的磷酸化以及对离子通道及其转导等方面的挺直作用，增加突触的兴奋传递速度，并影响抑制性神经元(尤其是gaba能神经元)的结构和功能，转变和调整神经元的兴奋性10。本试验室前期讨论表明，运动疲惫后纹状体区高频放电神经元比例显著增加，可能是bdnf与其特异受体结合诱导神经细胞兴奋性增加的结果。但准确机制还需进一步的试验证明。 4 小 结1） 运动疲惫大鼠海马锥体细胞出现固缩、肿胀和碎裂，星形胶质细胞胞体增大、突起增粗等形态学改变特征，且海马和纹状体区bdnf和gfap表达水平均显著上