慢性应激对糖尿病倾向鼠几种组织抗氧化酶影响的差异及其意义

1、    慢性应激对糖尿病倾向鼠几种组织 抗氧化酶影响的差异及其意义        摘要：目的：研究慢性应激对正常及糖尿病倾向小鼠各组织抗氧化酶影响的差异并探讨其意义。方法：用链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病倾向小鼠模型(STZ鼠)，予以6周慢性多相性应激(限制、旋转、拥挤)，检测其空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平和胰、心、肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷肽甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性及脂质过氧化物(LPO)含量。结果：慢性应激使STZ鼠FBG水平

2、升高，FINS水平未增高；对STZ鼠各组织抗氧化酶活性有不同影响：加重其胰腺SOD活性下降和LPO含量升高，并使其GSH-PX活性降低(P均<0.05)，对其肝脏显示使SOD、GSH-PX活性升高和LPO含量下降的相反作用(P均<0.05)。结论：慢性应激及STZ诱导的糖尿病倾向协同作用特异地加重小鼠胰腺抗氧化酶活性下降和脂质过氧化物形成，可能参与损害其胰岛素分泌功能和导致高血糖症。关键词：慢性应激糖尿病胰岛素抗氧化酶脂质过氧化物分类号：R395.1文献标识码：A文章编号：1005-3611(2000)01-0019-04Difference in Alterations of A

3、ntionxidant Enzyme Activities in Different Tissues of Diabetes-prone Mice by Chronic Exposure to Stressors and Its ImplicationsLIU YoushuoHU MinYAO Shuqiao et al,（Hunan Medical University, Changsha）Abstract：Objective：To investigate the degree of difference and direction of alterations of antioxidant

4、 enzyme activities in different tissues of normal and diabetes-prone animals by chronic stress and to explore its implications. Methods： The levels of fasting blood glucose (FBG) and fast plasma insulin (FINS), the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-PX) and leve

5、l of lipid peroxidate (LPO) were measured in the pancreas, heart and liver of normal and streptozotocin-induced diabetes-prone mice (STZ mice) exposed to multiple stressors (restrain, rotation, crowding) for 6 weeks. Results： The FBG level in STZ mice was elevated by stress, while the FINS level was

6、 not increased. In the pancreas of STZ mice, SOD activity was decreased and LPO formation increased (P<0.05); these negative changes resulting from STZ were exacerbated by chronic stress (P<0.05). However, opposite changes occurred in the liver of STZ mice after chronic stress (increased in SO

7、D and GSH-PX activities, decreased in LPO content, P<0.05). On the other hand, chronic stress resulted in less change in normal mice (increased in SOD activity in heart, P<0.05). Conclusion： The synergistic actions of chronic stress and STZ-induced diabetes-prone status can exacerbate the decr

8、ease of antioxidant enzyme activities and formation of LPO in the pancreas of mice specifically. This may impair insulin secretion and promote heperglycemia in STZ mice.Key words：Chronic stress, Diabetes mellitus, Insulin, Antioxidant enzymes, Lipid peroxidation近年来，大量研究表明，抗氧化酶活性下降和/或氧自由基增加与糖尿病发病及并发症

9、发生有着密切关系1。我们的系列研究以小剂量链脲佐菌素(STZ)重复注射引起昆明小鼠胰岛较轻微的病理损伤，诱导动物的糖尿病倾向，用以研究实验性糖尿病的环境促发因素及作用机理2，已发表的报道显示慢性应激可促使STZ诱导的糖尿病倾向小鼠(简称STZ鼠)血糖持续升高，且可能有中枢及外周的多种神经内分泌因素共同参与其促发过程3。为获取慢性应激作用于实验动物引起的累积性的重要病理生理改变信息，我们选择STZ的特异靶标组织(胰腺)、糖尿病并发症有关的组织(心脏)和氧化代谢的主要器官(肝脏)进行观察，对比分析正常鼠与STZ鼠慢性应激后以上各组织抗氧化酶活性和氧自由基反应产物的变化，并讨论其意义。1对象与方法1

10、.1对象若干新生同龄昆明小鼠(生后710天，雌雄各半，体重4.5±0.3 g)，随机取80只鼠腹腔内注射STZ(美国Sigma公司产品，溶解在0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液内，PH4.0)，40 mg/kg，1次/天，连续2天(简称STZ鼠)；另取40只鼠腹腔内注射等量柠檬酸缓冲液(简称正常鼠)。注射后30天查血糖，以13.9 mmol/L为标准，筛去高血糖症鼠，再随机选取40只STZ鼠和20只正常鼠(雌雄各半)进行实验。STZ鼠按血糖、性别匹配后随机分入对照组20只和应激组20只，正常鼠也依上匹配后分入对照组10只和应激组10只，4组实验鼠血糖基础值差异无显著性。动物室内光照时间

11、上午8点至下午8点，室温保持24 ，通风良好，喂以全价营养饲料，自由进食饮水，除实验应激外无其他不良刺激。1.2方法1.2.1慢性应激源参照Carter等4建立的慢性、多相性应激法，经改良后建立本实验的应激方法：(1)限制：将小鼠放入空底12 cm×5 cm×5 cm铁盒内，置于栅板上，保证小鼠不受压，但运动受限，且无光源，限制刺激每周随机择时进行3次，每次30分钟；(2)旋转：自制旋转器，转速为33转/分，在此转速下离心力最小，旋转刺激每45150分钟内进行1次，每次15分钟；(3) 拥挤：标准小鼠笼，按应激组10只/笼，对照组5只/笼喂养。应激组从鼠龄45天起开始给予以

12、上应激，持续6周。1.2.2标本采集应激实验前、后剪鼠尾取血测空腹血糖(FBG)各1次；应激实验6周后，断头处死全部实验鼠，将血液收集在预冷试管内(含1mg/L Na2EDTA20 l,抑肽酶20 l)，充分混匀后低温离心20分钟(4 ，3000转/分)，取上清液贮于-70 冰箱待测血浆胰岛素(FINS)；钝性分离胰腺、心脏、肝脏，用预冷(4 )生理盐水冲洗，滤纸吸净表面残液，然后各剖取部分组织按110(WV=1 g10 ml)加入预冷(4 )匀浆液(0.15 mol/L磷酸盐缓冲液，PH7.4，含1 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂)，冰浴匀浆后部分分装待测各组织脂质过氧化物(LPO)含量；各组

13、织其余部分匀浆离心30分钟(4 ，14 000 g)，取上清，待测总蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。1.2.3检测方法采用ONE TOUCH快速血糖仪及配套的试纸(美国Lifescan公司产品)测试FBG水平；放免法测定FINS浓度(试剂盒由华西糖尿病科技开发研究所提供)；邻苯三酚自氧化法测各组织SOD活性；DTNB法测各组织GSH-PX活性；TBA法测各组织LPO含量。另采用Bradford法测定总蛋白含量。2结果2.1各实验组体重、空腹血糖水平和空腹血浆胰岛素浓度的比较6周实验后STZ鼠体重增加较少，应激的STZ鼠体重增加尤少(P均<0.0

14、5)；STZ鼠FINS浓度基础值低于正常鼠(P<0.05)，慢性应激实验后STZ鼠FBG水平显著增高(P<0.05)，但其FINS浓度无上升，提示慢性应激使STZ鼠对高血糖刺激的胰岛素分泌反应缺乏(见表1)。表1各实验组WT、FBG水平及FINS浓度(±s)WT(g)FBG(mmol/L)FINS(mIU/L)实验前实验后变化率(%)实验前实验后实验后正常鼠对照组(n=10)25.1±2.940.1±5.360.0±5.47.0±0.96.2±0.735±16应激组(n=10)24.6±2.738.3&

15、#177;5.255.7±4.67.1±1.05.9±0.724±13STZ鼠对照组(n=20)30.3±4.041.8±3.738.5±3.9*7.9±1.66.7±1.622±10应激组(n=20)28.5±3.336.4±4.527.5±4.2*8.0±1.510.3±6.2*20±6注：WT：体重；FBG：空腹血糖；FINS：空腹血浆胰岛素；* 表示与其余各组比较均P<0.05;表示与正常鼠对照组比较P<0.05 2

16、.2各实验组胰腺、心脏、肝脏SOD、GSH-PX活性和LPO含量的比较STZ鼠对照组几种组织与正常鼠对照组比较，仅胰腺组织SOD活性下降，LPO含量升高(P值均<0.05)。6周应激后，正常鼠仅其心脏组织SOD活性升高(P<0.05)；STZ鼠胰腺SOD活性进一步下降、GSH-PX活性降低、LPO含量进一步升高(P均<0.05)，肝脏SOD和GSH-PX活性上升，LPO含量下降(P均<0.05)(见表2)。表2各实验组胰腺、心脏、肝脏SOD、GSH-PX活性和LPO含量(±s)正常鼠STZ鼠对照组(n=10)应激组(n=10)对照组(n=20)应激组(n=20

17、)胰腺SOD(U/mg总蛋白)1.40±0.071.37±0.131.14±0.10*0.91±0.25GSH-PX(mU/mg总蛋白)87±790±687±853±9LPO(mol/g湿组织)1.01±0.531.36±0.803.75±1.27*5.34±1.36心脏SOD(U/mg总蛋白)2.21±0.203.58±0.36*2.19±0.122.23±0.24GSH-PX(mU/mg总蛋白)113±12126±

18、;1496±19104±17LPO(mol/g湿组织)0.93±0.311.02±0.430.98±0.251.10±0.28肝脏SOD(U/mg总蛋白)3.28±0.563.49±0.483.62±0.424.88±0.39GSH-PX(mU/mg总蛋白)124±10133±26126±19211±38LPO(mol/g湿组织)1.50±0.431.42±0.380.61±0.471.10±0.31注：SOD：超氧

19、化物歧化酶；GSH-PX：谷胱甘肽过氧化物酶；LPO：脂质过氧化物；* 与正常对照组比较P<0.05；与STZ鼠对照组比较P<0.05 3讨论3.1慢性应激和STZ诱导的糖尿病倾向的独立作用对小鼠各组织抗氧化酶的影响及意义为数众多的应激实验证实强烈的急性应激源(如低温、电击等)可引起正常机体抗氧化酶和氧自由基反应的显著变化，但中等强度的慢性应激源是否影响正常机体抗氧化酶活性仍是一个有争论的问题。Wood等5以为期2周的间断限制为慢性应激源，未观察到正常Wistar大鼠心、肝等组织抗氧化酶活性的变化；我们的研究发现为期6周的慢性多相性应激使正常昆明小鼠心脏SOD活性上升。两个研究结果

20、之间的差异可能与实验动物品系及应激源的性质、强度不同有关。本研究还发现慢性应激的独立作用未改变正常鼠胰腺的SOD、GSH-PX活性和脂质过氧化反应程度。本研究结果还表明，STZ诱导的糖尿病倾向小鼠不同组织中，仅胰腺SOD活性下降，伴脂质过氧化反应程度加重，这与另外一些有关小剂量STZ特异损伤胰腺是通过抑制胰腺SOD活性而起作用的实验结果6，7相互支持。另外，STZ鼠心脏、肝脏SOD活性及心脏GSH-PX活性未发生变化与他人的研究结果一致5或不一致8；Wood等5的研究结果显示STZ鼠肝脏GSH-PX活性下降与本研究显示其活性不变的结果也不相同。造成这些差异的原因可能部分与STZ剂量大小和动物品

21、系不同有关，糖尿病的严重程度及病程也是不可忽视的因素。3.2慢性应激与STZ诱导的糖尿病倾向协同作用对小鼠各组织抗氧化酶的影响及意义本研究结果显示，慢性应激后STZ鼠各组织抗氧化酶活性及氧自由基反应呈现复杂的变化，但仅有其胰腺中的变化是明显有害的：其SOD活性进一步下降，GSH-PX活性也降低，脂质过氧化反应程度更为加重，这是慢性应激与STZ诱导的糖尿病倾向协同作用的结果。该结果同时支持心身医学理论的一个重要观点，即负性刺激趋向于最先损害弱化的器官。胰腺是对氧自由基损伤最易感的组织之一。一方面正常个体胰腺的抗氧化酶活性低，另一方面胰腺内、外分泌组织均含大量的内质网系统，这些富含多不饱和脂肪酸的

22、膜结构在局部SOD活性被STZ所抑制的状态下极易受氧自由基的攻击6，从而脂质过氧化反应增强，氧自由基清除酶类却进一步消耗，因此局部脂质过氧化损伤不断积累。内质网的损伤可直接使胰岛合成胰岛素等肽类激素减少，国内张桂珍等9还发现补充抗氧化剂对抗脂质过氧化反应可显著改善抗氧化酶缺陷大鼠的胰岛素分泌。由此，笔者认为：在慢性应激促发STZ鼠持续血糖增高的过程中，其胰腺局部脂质过氧化损伤累积可能是造成STZ鼠对高血糖刺激的胰岛素分泌反应缺乏的重要病理生理基础。另外，本研究显示慢性应激还使STZ鼠肝脏SOD、GSH-PX活性升高，LPO含量下降。有他人的研究提示：慢性应激后STZ诱导的糖尿病鼠中某些组织抗氧

23、化状态和脂质过氧化反应改善，是慢性应激降低其血脂水平的结果5。但本研究中STZ鼠肝脏中上述抗氧化酶和脂质过氧化反应的变化对长期糖尿病状态下并发症的发生、发展有何益处，尚等进一步研究。作者单位：刘幼硕（湖南医科大学附二院，长沙，410011）胡敏（湖南医科大学附二院，长沙，410011）姚树桥（湖南医科大学附二院，长沙，410011）蔡伟雄（湖南医科大学附二院，长沙，410011）戴晓阳（湖南医科大学附二院，长沙，410011）龚耀先（湖南医科大学附二院，长沙，410011）参考文献：1Oberley LW. Free radical and diabetes. Free Radic. Biol

24、. Med, 1988,5：113-1242Surwit RS, Williams PG. Animal models provide insight into psychosomatic factors in diabetes. Psychosomatic Med, 1996,58：582-5893姚树桥，蔡伟雄，戴晓阳等.实验性应激对链脲佐菌素诱导鼠血糖增高的机理研究.中华医学杂志，1999，79：332-3344Carter WR, Herman J, Stokes K. Promotion of diabetes onset by stress in BB rat. Diabetologia, 1987,30：674-6755Tolekis PM