实验二、蛋白质定量测定课件

1、实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定( (一一) )基本原理基本原理 分光光度法是利用物质对某种波长的光具有分光光度法是利用物质对某种波长的光具有的的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。 Lambert-Beer定律，吸光度与溶液的浓液成正比，与光束通定律，吸光度与溶液的浓液成正比，与光束通过溶液的距离过溶液的距离(即光程即光程)成正比，用数学表达式表示为：成正比，用数学表达式表示为： C：物质的浓度，：物质的浓度，L：光程（：光程（cm），），K为吸光系数或消光系数。为吸光系数或消光系数。实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量

2、测定根据根据Lambert-beer定律：定律： 标准管：标准管：As=KLCs (下标下标S：标准液：标准液) 待测管：待测管：Ax=KLCx (下标下标X：待测液：待测液)L相等，温度相同，测定同一物质，所用单色光相同，则相等，温度相同，测定同一物质，所用单色光相同，则K相同，则：相同，则： As/Ax=Cs/Cx即即Cx=Ax/AsCs在实际操作中，常使待测管体积与标准管体积相等在实际操作中，常使待测管体积与标准管体积相等(以以X代表测定管含量，代表测定管含量，S代表标准管含量代表标准管含量)则：则： 计算待测溶液浓度时，可根据测定时计算待测溶液浓度时，可根据测定时的的和和将上式演变为：

3、将上式演变为： 待测溶液浓度待测溶液浓度实验二、蛋白质定量测定 (1) (1) 又叫做又叫做。从浓度一光密度直线的。从浓度一光密度直线的直线特性，判断所采用方法的直线特性，判断所采用方法的。 (2)(2)作作绘制标准曲线，可判断在整个测定过程绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作、仪器等误差的大小，确定该中操作、仪器等误差的大小，确定该。 (3)(3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的。 (4)(4)大批样品分析时，大批样品分析时，从光密度值直接查阅，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。标准曲线而求得被测物质的浓度。实验二、蛋白质定量测定

4、(1) (1) 标准液浓度的选择：标准液浓度的选择：标准液浓度选择一般应能包括待测样标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般品的可能变异最低与最高值，一般。浓度差。浓度差距最好是距最好是。(2) (2) 标准液的测定：标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读在比色时，读取光密度至少读2-32-3次，求次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。(3) (3) 标准曲线图的绘制：标准曲线图的绘制：一般常用一般常用。实验二、蛋白质定量测定【操作】【操作】试剂试剂标准管标准管测定管测定管空白管空白管1 2 3 4 5 6 7蛋白质标准液

5、蛋白质标准液(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待测血清样本待测血清样本(ml) 1.00.9%NaCl(ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0双缩脲试剂双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0实验二、蛋白质定量测定3 3、标准曲线图的绘制、标准曲线图的绘制 用普通方格纸作图。图纸长用普通方格纸作图。图纸长宽宽=11=11或长或长宽宽=32=32，以横轴为浓度，纵轴为光密度。，以横轴为浓度，纵轴为光密度。绘制标准曲线时，将各座标点和原点连成一条线。绘制标准曲线时，将各座标点和原点连成一条线。若各点不在一直线，则可若各点不在一直线，则可通过原

6、点通过原点，尽可能使直线，尽可能使直线，使不在直线上的点尽量，使不在直线上的点尽量。座标纸上注明：测定物及测定方法的名称，仪器型座标纸上注明：测定物及测定方法的名称，仪器型号、波长及绘制的日期、室温。号、波长及绘制的日期、室温。实验二、蛋白质定量测定根据Lambert-Beer定律，定律， 配制一系列标准液配制一系列标准液C1、C2、C3，在在 max下，测相应的下，测相应的A1、A2、A3。实验二、蛋白质定量测定 根据根据Lambert-Beer氏定律：氏定律：A=KLC 若若C为为1%（g/ml），），L为为1cm，此时的，此时的K值称为百分吸光值称为百分吸光系数用系数用E1%1cm表示表

7、示.即：即：C=A/E1%1cm 若若，其，其K值称为值称为用用表示即；表示即； C=A/实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定 根据三个原则：根据三个原则： 1.1.被测溶液有适当的光密度，适当的光密被测溶液有适当的光密度，适当的光密度为度为0.1- 0.70.1- 0.7，以，以0.2- 0.60.2- 0.6最理想。最理想。 2.2.应使干扰影响降低至最低限度。应使干扰影响降低至最低限度。 3.3.应使标准曲线在尽可能大的范围内接近应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。直线。实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定 双缩脲双缩脲(N

8、H(NH2 2CONHCONHCONHCONH2 2) )在碱性溶液中与硫酸铜反应在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为生成紫红色化合物，称为双缩脲反应双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多肽键蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)(-CONH-)在碱性溶液中在碱性溶液中也能与也能与CuCu2+2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其其。 操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小；操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小； 灵敏度较差，特异性不高。灵敏度较差，特异性不高。-CONH-CONH2 2、 -CH-CH2 2NHNH2 2、 -CS-N

9、H-CS-NH2 2等基团也有此反应。等基团也有此反应。实验二、蛋白质定量测定【操作】【操作】试剂试剂标准管标准管测定管测定管空白管空白管1 2 3 4 5 6 7蛋白质标准液蛋白质标准液(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待测血清样本待测血清样本(ml)1.0 0.9%NaCl(ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0双缩脲试剂双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0实验二、蛋白质定量测定( (一一) )在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。为横座标绘制标准曲线。( (二二) )从从待测血清样本的蛋白质浓度待测血清样本的蛋白质浓度(g/L)(g/L)，并求出