BMSCsPluronic F127水凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究

1、BMSCsPluronic F127水凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究         11-03-25 11:10:00     编辑：studa20                  作者：李果,吴小涛,王运涛,樊守刚,王锋  【摘要】  目的：探讨兔BMSCsPlur

2、onic F127凝胶复合体移植治疗椎间盘髓核缺损退变的效果,为临床应用提供实验依据。方法：6只1月龄健康新西兰白兔,雌雄不限,各取骨髓2 ml,分离培养BMSCs。取第3代骨髓间充质干细胞（BMSCs）,与Pluronic F127水凝胶混匀,制备成BMSCsPluronic F127水凝胶复合体。将18只新西兰大白免建立椎间盘髓核缺损退变动物模型,并随机分为3组(n=6)。正常对照组仅分离暴露椎间盘,不作任何处理；移植治疗组将25 l BMSCsPluronic F127水凝胶复合体注入缺损椎间盘中心；缺损退变组仅注射入0.01 mol·L-1PBS液25 l。8周后处死动物,取

3、出脊柱，应用MRI测量各椎间盘的信号强度和邻近椎旁肌肉的信号强度,计算信噪比；取出相应椎间盘行阿尔辛蓝过碘雪夫(ABPAS)染色及型胶原免疫组织化学染色,切片行灰度值测定和分光光度计测定蛋白多糖含量。结果：3组椎间盘信噪比差异有统计学意义(P0.05)。ABPAS染色显示,正常对照组及移植治疗组椎间盘染色明显,椎间盘结构清晰；缺损退变组椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清。移植治疗组型胶原和蛋白多糖的含量明显高于缺损退变组(P0.05),但与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论：兔BMSCssPluronic F127水凝胶复合体可修复椎间盘缺损退变,本研究为临床应用可注

4、射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变奠定了实验基础。 【关键词】  水凝胶； 组织工程； 椎间盘； 骨髓间充质干细胞    Abstract Objective: To investigate the therapeutic effect of BMSCsPluronic F127 hydrogel complex transplantation on intervertebral disc degeneration and to provide experimental basis for its clinical application.Methods

5、: Two milliliter of bone marrow from 6 healthy onemonthold New Zealand rabbits were selected to isolate and culture BMSCs. Then, BMSCs at passage 3 were mixed with Pluronic F127 hydrogel to prepare BMSCsPluronic F127 hydrogel complex. Eighteen rabbits were selected to establish the model of interver

6、tebral disc degeneration and divided into 3 groups randomly(n=6 per group): control group in which intervertebral disc was separated and exposed but without further processing; transplantation group in which 25 l of autogenous BMSCsPluronic F127 hydrogel complex was injected into the center of defec

7、ted intervertebral disc; degeneration group in which only 25 l of 0.01 mol·L-1 PBS solution was injected. Animals were killed 8 weeks later and the repaired discs were obtained. The changes of the intervertebral disc signalnoise ratio  were showed by MRI and the proteoglycan was quantitate

8、d by spectrophotometer to observe the repair effect.The collagenase expression was detected by immunohistochemistry. Results: The signalnoise ratio had a significant difference among the three groups(P0.05). ABPAS staining showed that intervertebral disc in the control and transplantation groups wer

9、e stained obviously, with a clear structure; while the intervertebral disc in the degeneration group demonstrated a deranged structure with an indistinct division between the nucleus pulposus and the anulus fibrosus. The content of collagenaseand proteoglycan of transplantation group had significant

10、 difference comparing with that of degeneration group(P0.05), but there was no significant difference between the control group(P0.05). Conclusion: The rabbit BMSCsPluronic F127 hydrogel complex can repair intervertebral disc degeneration and it provide an experimental foundation for the clinical ap

11、plication of injectable tissue engineered nucleus pulposus complex to treat intervertebral disc degeneration.Key words hydrogel； tissue engineering； disc； bone mesenchymal stem cell    下腰痛(low back pain,LBP)是骨科最常见的临床症状之一,最新统计1显示,LBP对美国的年经济负担已达196到1188亿美元。20%的下腰痛都是因椎间盘退行性疾病(interverteb

12、ral disc degeneration disease, IVDD)所引起的。当前临床主要采取椎间盘切除、脊柱融合等非针对退变病因本身的手术治疗,虽然可缓解症状却难以扭转退变2,反而会引起继发的脊柱不稳或加速相邻椎间盘的退变(adjacent segment disease, ASD)3。近年来,随着着生物治疗概念的提出和发展,通过生长因子、基因干预、细胞移植等手段及时干预退变的诸多环节,为扭转和修复椎间盘退变带来希望4。我们设想在对IVDD患者行椎间盘髓核摘除术的同时,将某些具有生物活性的组织移植入椎间盘髓核缺损中,是否会对缺损的椎间盘有修复作用?目前国内外尚少见关于Pluronic F

13、127与骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合后植入的体内实验报道。我们以BMSCs为种子细胞,温固化水凝胶Pluronic F127为支架,在低温下将复合物注射入椎间盘髓核缺损退变的动物模型中,检测其修复效果,为进一步的临床应用提供实验依据。    1  材料和方法    1.1  材料    18只成年新西兰大白兔,体重22.5 kg,雌雄不拘,由江苏省农科院动物实验中心提供。LGDMEM培养基(美国Gibco公司),100%胎牛血清(杭州四季青公司),胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(美国Sig

14、ma公司),Percoll比重1.077g·L-1(美国Pharmacia公司),Pluronic F127(Sigma公司)，鼠抗人型胶原抗体以及Elivision plus免疫组织化学试剂(迈新公司),阿尔辛蓝过碘雪夫染料（展晨生物），7.0 T microMRI(德国Bruker公司),环境扫描电镜(Philips公司)。    1.2  方法1.2.1  兔BMSCs的分离、纯化、培养 取1月龄的新西兰大白兔6只,雌雄不拘,2%的戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)耳缘静脉施以全身麻醉,在无菌操作下于双侧胫骨

15、上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约23 mm的孔,使通达髓腔，各抽取骨髓2 mL。采用密度梯度离心法分离培养BMSCs。倒置显微镜下逐日观察细胞形态并拍照记录。812 d细胞长满瓶底90以上,以0.25胰蛋白酶消化,按1传2比例分瓶接种传代培养。取第3代细胞进行移植注射。1.2.2  Pluronic F127支架的的构建 将Pluronic F127材料15 g融解于50 ml PBS,在冰浴下磁力搅拌过夜,使Pluronic均匀溶解于PBS。高温高压条件下灭菌处理20 min后置于4 冰箱。1.2.3  BMSCs与Pluronic F127复合物的

16、制备 取生长良好的GFP阳性BMSCs细胞进行消化,1 000 r·min-1离心5 min,弃去上清液,将浓缩的细胞团吹散,制成细胞浓度为1×106个ml-1的细胞悬液，转移至离心管中,冰盒内预冷10 min。吸取30%Pluronic凝胶,加入上述含细胞的离心管中,再在冰浴下在振荡器上将细胞和凝胶混合均匀。将预冷的微量注射器针芯拔掉,用1 ml预冷的无菌注射器吸取细胞材料复合物注入微量注射器中,置于4 冰箱备用。1.2.4  实验动物分组及模型的建立 18只成年新西兰大白兔随机分为正常对照组、移植治疗组和缺损退变组，每组6只。穿刺制作椎间盘

17、退行性变模型：在全麻下,兔右侧卧位,以横突为轴心,沿左侧第12肋末向下至髂嵴上缘作纵切口,在骶棘肌和腰方肌外缘于胸腰筋膜前层间钝性分离。近腰方肌前内缘触及横突,剪开胸腰筋膜,用小指钝性分离腰大肌即可显露椎间盘。用21号针头分别在L45、L56进行穿刺,抽吸出的髓核组织,每个椎间盘约抽吸出的髓核组织湿重约23 mg,并立即在显微镜下观察以确定只有髓核组织5。移植治疗组用预冷的微量注射器将BMSCsPluronic F127复合物25 l注入缺损的椎间盘中心；缺损退变组注射磷酸缓冲液(PBS)25 l；正常对照组仅分离暴露椎间盘,不作任何处理。术后在每个相应椎间盘旁的横突上用黑色缝合线做标记,然后

18、冲洗、止血,依次逐层关闭切口,肌肉注射青霉素40万U，连续3 d以预防感染。1.2.5  MIR成像 MIR成像水平扫描架内径16 cm,使用61 mm大鼠体部线圈。扫描采用TurboRARE T2WI序列。扫描主要参数：FOV 60 mm×40 mm, TR/TE 4 200 ms/36 ms,层厚1.0 mm,层间距0.5 mm,FA 180°,Matrix 256×256,空间最小分辩率为234 m×156 m/像素,总扫描时间约为1 min 20 s。1.2.6  疗效观察 (1) 影像学检查。术后8周耳缘

19、静脉注射空气栓塞处死动物,迅速取出脊柱,进行MIR成像。采用Bruker 7.0T microMIR自带的paravision 4.0软件测量3组椎间盘的信号强度和邻近椎旁肌肉的信号强度,计算信噪比(SNR,signalnoise ratio)以评估各组椎间盘退变水平和治疗效果。信噪比计算公式：SNR=SI/noise6，SI定义为椎间盘的信号强度,noise定义为椎旁肌肉信号强度的标准差。(2) 病理学检查。MIR扫描完毕,根据定位标记,取出相应椎间盘后置4%中性甲醛固定,石蜡包埋切片,片厚4 m，行胶原免疫组织化学染色、ABPAS染色。型胶原免疫组织化学染色结果判断:髓核组织间质呈棕黄色为阳性。应用LeicaQ550 IW计算机图像分析系统及其软件(LeicaQwin Pro.2.2)定量评价呈阳性免疫染色的椎间盘细胞间质的灰度值(灰度分级0255级,0级为最深,255级为最浅),每只椎间盘取4张切片,每张切片随机采集4个高倍视野(×200)进行测定,向同一个方向移动切片,不重叠,不重复。测得结果为视野内棕黄色的平均灰度值。(3) 蛋白多糖含量测定。取出椎间盘髓核组织,放入5 ml离心管中。加