缺氧诱导的心肌细胞凋亡及一氧化氮的保护作用

1、    缺氧诱导的心肌细胞凋亡及一氧化氮的保护作用        摘要：目的研究缺氧在新生大鼠心肌细胞凋亡中的作用及一氧化氮(NO)的保护作用。方法取 体外培养的新生大鼠心肌细胞置950 mL/L N2， 50 mL/L CO2孵箱中培养16， 32和 48 h， 造成缺氧损伤的细胞模型，观察凋亡发生的情况；将 NO供 体 SNAP加入培养基中，使其终浓度为100 mol/L， 置于上述缺氧环境中培养16，32和48h，检测细胞凋亡。 结果在缺氧条件下培养16， 32， 48

2、 h后 ， 心肌细胞的凋亡率分别为：(2.9± 0.5) ， (6.2± 0.8) 和 (26.6± 3.0) ;而加入NO供体后，凋亡率分别为：(0.2± 0.3) ， (3.4± 0.4) 和 (11.8± 1.2) 。 结论凋亡是心肌细胞缺氧损伤的主要形式；NO对缺氧引起的心肌细胞凋亡有保护作用。关键词：缺氧；凋亡； 一氧化氮；心肌细胞中号 ：R364.4 R392.12文献标识码：A 文章编号：10078738(2000)03022503Hypoxia-induced apoptosis of cardiomyocyte an

3、d the protection of nitric oxideZHANG Feng12, LUO Xiao? xing1, ZHAO De? hua1（Department of Pharmacology,Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032, Shaanxi Province， China）CAO Yun-xin（Central laboratory,Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032, Shaanxi Province， China）Abstrac

4、t： Aim To study the role of hypoxia? induced apoptosis in neonatal rat cardiomyocyte and the protection effect of nitric oxide(NO). Methods Neonatal rat cardiomyocytes were cultured in an incubator of 950 mL/L N2 and 50 mL/L CO2 for 16， 32 and 48 h to create cell models of hypoxia injury and detect

5、apoptosis. And NO donor SNAP at 100 mol/L was added to the models. Apoptosis was detected in the hypoxia cells without or with No treatment. Results After hypoxia of 16， 32 and 48 h,the apoptosis rates of cardiomyocytes were 2.9 ± 0.5 ， 6.2 ± 0.8 and 26.6 ± 3.0 ， respectively. Whereas

6、 the apoptosis rates of cells treated with SNAP were 0.2 ± 0.3 ， 3.4 ± 0.4 and 11.8 ± 1.2 , respectively. Conclusion Apoptosis is the main form of hypoxia injury in cardiomyocytes; NO protect cardiomyocytes from apoptosis induced by hypoxia.Keywords： hypoxia； apoptosis； nitric oxide；

7、cardiomyocyte长期以来，人们一直认为心肌细胞坏死是心肌缺血这一过程的病理机制。随着细胞凋亡现象在多种心血管系统疾病(如心衰、心律失常等)的发现，一些学者提出，细胞凋亡可能是心肌缺血损伤机制中的一个重要环节1。目前，对凋亡的研究多集中在肿瘤细胞及免疫细胞，对于缺氧直接作用于体外培养的心肌细胞而致其凋亡，国内尚未见报道，国外的研究也较少，但这个问题已开始为许多学者所重视。NO是目前的研究热点之一，它被认为是重要的气体第二信使，参与多种生物过程。在对免疫细胞的研究中发现，它既可诱导细胞凋亡也可抑制细胞凋亡2，3,而其对缺氧引起的心肌细胞凋亡有无影响，国内外尚无此方面的报道。心肌缺血最关键

8、的因素是心肌细胞缺氧。我们通过在细胞水平模拟心肌缺血损伤，利用不同的方法，观察了心肌细胞在缺氧不同时间发生凋亡的情况及NO对此过程的影响，以探讨凋亡发生率与心肌细胞缺氧之间的关系，以及NO对缺氧引起心肌细胞凋亡的保护作用。1材料和方法1.1材料新生SD品系大鼠仔鼠(13d龄)购于本校实验动物中心。转铁蛋白购于Gibco公司。Bromodeoxyuridine(Brdu)购于Sigma公司。胎牛血清购于Hyclone公司。高糖及低糖DMEM购于Hyclone公司。DNA末端标记凋亡检测试剂盒(ApoAlertTMDNAFragmentationAssayKit)购于Clot?ech公司。NO供体

9、S?nitrosopenicillamine(SNAP)及C2?Ceramide购于Sigma公司。细胞周期及凋亡染色试剂(DNA?PrepStain)为Coulter公司的产品。1.2方法1.2.1新生大鼠心肌细胞的培养取13d龄SD仔鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，经胶原酶消化，以高糖DMEM制成单细胞悬液，用差速贴壁法于3750mL/LCO2孵箱中培养45min。由于纤维细胞较心肌细胞更易于贴壁，用此法可使大部分纤维细胞贴壁，剩下富含心肌细胞的培养液。将此培养液离心，再次接种于含100mL/L胎牛血清、0.1mmol/LBrdu的高糖DMEM中，细胞密度约为5×108个/L。其中

10、胎牛血清可进一步促进心肌细胞的生长，而Brdu可抑制纤维细胞增殖。按此法培养的心肌细胞，培养后12h即可见部分细胞收缩。24h后换液，换用含转铁蛋白和胰岛素的高糖DMEM，去除血清和Brdu，此时心肌细胞约90以上都在收缩，速率达96120次/min。1.2.2缺氧条件下培养心肌细胞首先，将高纯度氮气(N2)通入低糖DMEM中30min。取生长4d的单层心肌细胞，换用N2饱和的低糖DMEM，将心肌细胞分为两组，其中一组加入SNAP，使其终浓度为100mol/L。两组同时放入3750mL/LCO2，950mL/LN2孵箱中，在此缺氧条件下分别培养16，32和48h。1.2.3HE及TUNEL染色

11、取心肌细胞爬片，用950mL/L乙醇固定、常规HE染色。另取一些心肌细胞爬片，以40mL/L甲醛/PBS于4固定25min。将细胞爬片浸入2mL/LTriton?X-100/PBS液中，使细胞通透性增强，加用荧光素FITC标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)的混和液，于37作用60min。在荧光显微镜下观察,以核阳性作为结果判定的标准。阴性对照为不加TdT液处理的细胞,阳性对照为以终浓度100mol/L的C2?Ceramide处理4h的细胞。1.2.4流式细胞仪检测凋亡率分别取正常条件下培养的心肌细胞和缺氧条件下不同时间培养的心肌细胞，加入SNAP后在正常条件下培养的心肌细胞及加入SN

12、AP后在缺氧条件下培养不同时间的心肌细胞。经2.5g/L胰蛋白酶消化后，用0.01mol/LPBS洗涤2次，并以PBS调整细胞密度为1×109个L，制成单细胞悬液,加入2mL预冷的无水乙醇固定细胞4。上机前，收集所有固定标本，离心去上清，用PBS洗2次，调整至终体积为100L。加入DNA?Stain染色液500L，于室温下避光染色20min，用EliteESP型流式细胞仪检测DNA含量的变化，分析细胞凋亡及细胞周期的变化。2结果2.1HE及TUNEL染色HE染色可见凋亡细胞的体积变小、胞核浓缩、胞质嗜酸性增强(1)。TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色荧光，位于胞核，呈小圆形、环形或新月

13、形(1)。经C2?Cer?amide作用的阳性对照呈阳性，去除TdT液的阴性对照呈阴性。1缺氧诱导的心肌细胞凋亡的HE及TUNEL染色Fig 1 Determination of hypoxia? induced cardiomyocyte apoptosis by HE and TUNEL staining A:HE staining(× 200); B:HE staining(× 400);C:TUNEL staining(× 200);D:TUNEL staining(× 400). 2.2流式细胞仪的分析缺氧不同时间后，经流式细胞仪检测显示明显的

14、凋亡峰(2)。缺氧培养16，32和48h后，心肌细胞的凋亡率分别为：(2.9±0.5)，(6.2±0.8)和(26.6±3.0);加入NO供体后其凋亡率分别为：(0.2±0.3)，(3.4±0.4)和(11.8±1.2)。经?2检验，缺氧组与正常培养组之间、缺氧各组之间凋亡率有明显的差异(P0.01)；缺氧相同时间，加入SNAP组与未加入组之间，凋亡率亦有明显的差异(P0.01)。2心肌细胞凋亡的流式细胞仪分析Fig2AnalysisofcadiomyocyteapoptosisbyflowcytometerN:Normalcondi

15、tion;H:Hypoxia.3讨论越来越多的证据表明，心力衰竭、心律失常和心肌病等心血管疾病的发生、发展与细胞凋亡现象有关。可以说，凋亡在心脏的正常生理、病理过程中几乎无处不在。本实验表明，在心肌缺血损伤中，细胞凋亡也有着重要的病理学意义。从本研究的结果来看，单纯缺氧即可诱导体外培养的心肌细胞发生凋亡，心肌细胞在缺氧16h及32h时，凋亡率分别为：2.9±0.5和6.2±0.8；而在缺氧48h时，凋亡率增至26.6±3.0。以上提示，在心肌缺血性疾病治疗中，一方面要在缺血早期及时改善心肌细胞的血液供应；另一方面要采取细胞保护措施，即抑制细胞凋亡，改善其功能状态。

16、细胞凋亡是一个主动的信号依赖性过程，目前人们已在不同的环节发现了一些介导凋亡的信号通路和分子，但凋亡的信号网络系统错综复杂，现在仍未明确。关于心肌细胞缺氧引起的心肌细胞凋亡的研究起步较晚，其信号通路更是知之甚少。随着对凋亡信号通路的揭示，将使我们有可能采取干预手段影响凋亡信号传递过程，促进或抑制凋亡，从本质上治疗疾病。NO是重要的气体第二信使，本研究发现，它对于体外缺氧诱导的心肌细胞凋亡有保护作用，这为长期以来一直用于治疗心肌缺血性疾病的硝酸酯类药物，提供了新的实验依据。目前认为，NO与其它凋亡传导途径之间存在着对话效应，它有可能作用于心肌细胞内其它介导凋亡的信号分子(如神经酰氨)，通过影响其

17、生成或释放而发挥保护作用。但NO是否对心肌细胞凋亡也有双重作用及其作用机制如何？尚待进一步研究。我们已确立心肌细胞缺氧损伤模型，揭示了凋亡和心肌细胞缺氧的关系，并探讨了气体第二信使NO在这一过程中的保护作用。在此基础上，我们还将进一步研究缺氧心肌细胞凋亡的信号转导过程，以期为临床上治疗心肌缺血、有效的保护心肌细胞提供新的思路和手段。作者简介：张峰，女，29岁，硕士生西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374555 ?2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit张峰（第四军医大学，药理学

18、教研室，陕西 西 安 710032）罗晓星（第四军医大学，药理学教研室，陕西 西 安 710032）赵德化（第四军医大学，药理学教研室，陕西 西 安 710032）曹云新（第四军医大学，中心实验室，陕西 西 安 710032）参考文献：1 Thomas NJ. Normal and abnormal consequences of apoptosis in the human heartJ . Annu Rev Physiol, 1998; 60: 309? 325. 2 Fehsel K, Kroncke KD, Meyer KL, et al. Nitric oxide induces apoptosis in