免疫共沉淀技术ppt课件

1、威斯腾生物技术中心 免疫共沉淀技术 定义及原理 操作流程 优点和不足 本卷须知 应用及实例 展望定义及原理u免疫共沉淀定义免疫共沉淀定义u 免疫共沉淀免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation,CO-IP)也称免疫共也称免疫共吸附或免疫下拉技术，能够从细胞裂解物吸附或免疫下拉技术，能够从细胞裂解物中特异性的分离并富集目标蛋白。中特异性的分离并富集目标蛋白。u u CO-IP是通过抗原抗体之间的专一性作是通过抗原抗体之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法。也是确定两种蛋白质在完整细胞内生法。也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用

2、的有效方法。理性相互作用的有效方法。u基本原理基本原理u 在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的偶联于，孵育后再加入与抗体特异结合的偶联于sepharose beads上的上的proteinA/G,与细胞与细胞中的抗体结合，形成一种复合物：目的蛋中的抗体结合，形成一种复合物：目的蛋白白/目的蛋白目的蛋白-抗目的蛋白抗体抗目的蛋白抗体-proteinA/G,经过变性凝胶电泳，复合物分开。经过变性凝胶电泳，复合物分开。u 最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。原理流程示意图原理流程示意图操作流程操作流程u免

3、疫共沉淀实验流程免疫共沉淀实验流程u(1)蛋白样品准备蛋白样品准备 （如果为细胞样（如果为细胞样品需先裂解）品需先裂解）u(2)抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应u(3)Protein A/G 与抗原抗体复合物结与抗原抗体复合物结合合u u(4)免疫复合物与免疫复合物与protein A/G 解离解离u （2%SDS煮沸处理）煮沸处理）u(5)分析鉴定分析鉴定 （Western Blot或质谱或质谱分析）分析）u实验流程如图所示实验流程如图所示优点和不足优点和不足u优点优点u1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物合物u2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的蛋

4、白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为影响。，可以避免人为影响。u缺点和局限性缺点和局限性u1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用互作用u2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用不能够确定第三种蛋白的桥联作用应用及实例应用及实例应用领域：应用领域： 免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为主要用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和和MS质谱分析鉴定准备样品。质谱分析鉴定准备样品。应用范围应用范围:1.寻找新的相互作用蛋白寻找新的相互作用蛋白2.验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用验

5、证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用实例实例鼻咽癌细胞中鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白的相结合蛋白的分离和鉴定分离和鉴定P53基因是一种人体抑癌基因，人体癌症一半由于基因是一种人体抑癌基因，人体癌症一半由于该基因突变失活该基因突变失活1.抗抗P53抗体与抗体与HEN1和和HEN2细胞总蛋白进行免疫细胞总蛋白进行免疫共沉淀。共沉淀。2.SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物3.切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱分析，得到相应肽列标签质谱分析，得到相应肽列标签4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究搜索数据库分析目的蛋白相关数据进

6、行后续研究染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀 (CHIP) (CHIP)研究体内研究体内DNADNA蛋白质相互作用的重要工具。蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。基因表达的关系。CHIPCHIP原理原理 在活细胞状态下固定蛋白质在活细胞状态下固定蛋白质DNADNA复合复合物物 将其随机切断为一定长度范围内的染色将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段质小片段 通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集

7、目的蛋白结合的地富集目的蛋白结合的DNADNA片段片段 对目的片断的纯化与检测对目的片断的纯化与检测操作步骤操作步骤一、固定一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质DNADNA复合物，然后用化学微球菌酶或者机械复合物，然后用化学微球菌酶或者机械超声波的手段将其随机切断为一定长度范围内超声波的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。的染色质小片段。二、免疫沉淀二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原原- -抗体反应形成抗体反应形成DNA-DNA-蛋白质蛋白质- -抗体复合体，然后抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNADNA片段。片段。三、纯化与检测三、纯化与检测 经蛋白质与经蛋白质与DNA DNA 解偶联，解偶联，DNADNA片片段纯化等处理后，用段纯化等处理后，用PCRPCR等方法检测等方法检测DNADNA与蛋白质与蛋白质的结合情况的结合情况. .本卷须知本卷须知超声波破碎条件的选择抗体量的选择PCR反应条件的选择Input对照阳性对照：如组蛋白抗体阴性对照：阴性引物条件选择对照设置基因表达基因表达: :反式因子和顺式作用元件之间反式因子和顺式作用元件之间相互作用。相互作用。 真核生物的基因组真核生物