Smad4、Smad7在慢性GVHD狼疮肾炎模型小鼠肾组织的异常表达

1、Smad4、Smad7在慢性GVHD狼疮肾炎模型小鼠肾组织的异常表达                        【摘要】  目的：初步探讨Smad4、Smad7蛋白在慢性移植物抗宿主病（GVHD）狼疮肾炎（LN）模型小鼠肾组织表达的变化及意义。方法：（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠12只随机分为模型组和正常对照组，于12周

2、处死，采用RTPCR研究各组肾组织Smad4、Smad7mRNA表达水平，应用免疫组织化学方法检测Smad4、Smad7蛋白在肾脏的定位表达，并观察各组小鼠24h尿蛋白排泄量。 结果：模型组和正常对照组小鼠肾组织均检测到Smad4、Smad7蛋白及mRNA的表达，模型组Smad蛋白及mRNA的表达均显著高于正常对照组（P<0.05）；模型组24h尿蛋白排泄量显著高于正常对照组（P<0.05）。结论：Smads信号通路的异常可能参与LN的发生发展。 【关键词】  移植物抗宿主病；狼疮肾炎；Smad蛋白；小鼠 狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性

3、红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者最常见和最严重的并发症之一，病理改变具有多样性及非均一性，以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭，是SLE患者的主要死因之一。肾脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，其主要的发生机制与肾小管上皮细胞转分化(transdifferentiation，EMT)、细胞外基质（ECM）沉积以及细胞内多种促纤维化信号途径被激活等有关。近年来许多研究结果表明，Smads信号通路与众多促纤维化信号途径（如TGF、Ang、CTGF、MMP/TI

4、MP等）之间存在交叉对话（crosstalk），该通路的功能失调在肾脏纤维化的发生发展中起着中心作用12，因此本研究以Smads蛋白作为切入点，观察Smad4、Smad7蛋白及其mRNA在移植物抗宿主病（GVHD）狼疮样小鼠肾组织表达的变化，初步探讨Smads蛋白是否参与介导GVHD狼疮样小鼠LN的发生发展。1  对象与方法1.1  研究对象810周龄的雌性（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠和67周龄雌性DBA/2小鼠均购自中山大学医学动物中心，体重(20.17±1.20)g，饲养于东南大学医学院SPF级动物房。1.2  模型的建立与

5、分组参照文献3，根据完全随机设计的原则，将810周龄的雌性（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠分为模型组（A组）和正常对照组（B组），每组6只。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺和淋巴结细胞制成单细胞悬液（约60%脾细胞、30%胸腺细胞和10%淋巴结细胞），用台盼蓝染色和细胞计数板计数，保证活细胞数大于95%，调整细胞浓度为50×106，分别于1、3、7、10d静脉注射于A组F1代杂交鼠体内建成GVHD LN模型。至12周处死动物，立即取下肾脏，去掉肾包膜，一部分冻于液氮中后移至-70低温保存，一部分置10%中性甲醛液中固定，石蜡包埋，制成4m厚的连续切片。1.3 

6、; 观察指标及检测方法    1.3.1  双缩脲比色法测定24h尿蛋白  将小鼠尿液经15稀释后按双缩脲比色法说明书操作。    1.3.2  肾脏病理组织学检查  将小鼠肾组织切片用常规HE染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理变化。    1.3.3  免疫组化染色检测Smad4、Smad7蛋白在肾脏的定位表达  用SP法(链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连结法)进行免疫组化染色（试剂均购自北京中杉生物技术有限公司）。将肾组织石蜡切片经二甲苯

7、脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，10%正常羊血清封闭，37孵育15min，分别滴加1150稀释的Smad4及1100稀释的Smad7兔抗小鼠多克隆一抗，4孵育过夜，再依次加入生物素偶联的羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，各37孵育15min，DAB（二氨基联苯胺）染色，显微镜下控制显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片镜检。磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。结果在高倍镜（400倍）下随机选择20个肾小球和20个视野肾小管间质，根据染色面积和强度按下列方法进行半定量评分：0，无染色或微弱染色；1，染色面积25%；2,

8、染色面积在25%50%之间；3,50%<染色面积75%；4,染色面积75%。       1.3.4  RTPCR分析各组肾组织Smad4、Smad7mRNA表达水平  （1）总RNA提取：从-70低温冰箱中取出肾组织迅速称取100mg，加入TRIzol（深圳晶美公司）匀浆提取总RNA。取5l总RNA进行甲醛变性凝胶电泳，紫外灯下观察28、18s条带清晰提示RNA完整无降解。（2）逆转录反应体系：用RTPCR试剂盒（日本TaKaRa）操作。在PCR管中依次加入10×RT缓冲液1l、 MgCl2（25

9、mmol·L-1）4l、Oligo dT 1l、dNTPs（10mmol·L-1） 2l、RNA酶抑制剂0.5l、AMV逆转录酶1l和总RNA 5l，放入Gene Amp Sys2tem 2400 PCR 扩增仪中，42逆转录50min，99灭活AMV逆转录酶5min，5 5min，所得cDNA于-20保存用于PCR扩增。（3）PCR扩增：GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计，Smad4及Smad7引物分别参照文献45由上海生工生物工程公司合成。序列如下：Smad4上游引物为5CAACACCCGC CAAGTAATC3，下游引物为5GACCCAAACGTCAC C

10、TTCA3，产物为649bp；Smad7上游引物为5TCCT GCTGTGCAAAGTGTTC3，下游引物为5 AGTAAGG AGGAGGGGGAGAC3，产物为164bp； GAPDH上游引物为5GTGGGC CGCTCTAGGCACCAA3，下游引物为5CTCTTTGTATCACG CACGATTTC3，产物为452bp。Smad4 PCR反应体系:5×PCR缓冲液 5l、MgCl2（25mmol·L-1）0.5l、dNTPs（10mmol·L-1）025l 、上游及下游引物（25mol·L-1）各0.5l，cDNA模板3.5l、 TaqDNA聚合

11、酶（5U·l-1）0.5l，补足双蒸水至25l；Smad7 PCR反应体系:5×PCR缓冲液5l、MgCl2（25mmol·L-1）0.5l、dNTPs（10mmol·L-1）0.25l 、上游及下游引物（25mol·L-1）各1l、cDNA模板2.5l、 TaqDNA聚合酶（5U·l-1）0.5l，补足双蒸水至25l。PCR 扩增仪扩增,Smad4条件为：94预变性2min,94变性30s,50退火30s,72延伸1min,共循环30 次，72终末延伸7min；Smad7改退火温度为52，其余与Smad4相同。（4）产物检测：Sma

12、d4、Smad7扩增产物在1 %琼脂糖凝胶中以110V 电压电泳50min，在含0.5mmol·L-1溴乙锭的溶液中染色20min。于Image Master VDS 凝胶扫描仪上成像,用Totallab V 2.01 凝胶图像分析软件进行面积灰度扫描，以待检指标与GAPDH吸光度的比值来表示其相对含量（目的基因相对表达量=目的基因条带吸光度/GAPDH基因条带吸光度）。1.4  统计学分析实验数据用x-±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析(q检验)，免疫组化评分结果用成组设计两样本比较的秩和检验，也可编秩后对秩次进行单因素方差分析，检验水准确定为P<0

13、.05。以上结果均用SAS 8.2统计软件处理。                             2  结    果2.1  各组小鼠24h尿蛋白检测结果GVHD狼疮样小鼠于首次注射淋巴细胞后第8周出现尿蛋白,A组小鼠24h尿蛋白总量在8、10和12周均显著高于

14、B组小鼠（P<0.05）。见表1。表1  各组小鼠24h尿蛋白检测结果2.2  肾组织病理检查结果A组小鼠肾组织大多肾小球系膜细胞和内皮细胞增生，系膜区明显增宽，大量基质沉积，可见部分硬化的肾小球；肾小管呈多灶性萎缩，管腔内可见大量蛋白管型；间质中有大量单个核细胞浸润和基质沉积。见图1。2.3  LN小鼠肾组织Smad4、Smad7表达的变化    2.3.1  免疫组化半定量分析结果  小鼠肾组织Smad4、Smad7蛋白主要表达在皮质肾小管上皮细胞内，肾小球表达弱于肾小管，髓质肾小管仅有少许分布。Smad

15、4、Smad7蛋白表达A组较B组均明显增强（P<0.05）。见表2及图2、3。    2.3.2  RTPCR半定量分析结果  Smad4、Smad7 mRNA表达A组与B组比较差异有显著性（P<0.05），见表3、图4。小鼠肾组织大多肾小球系膜细胞和内皮细胞增生，系膜区明显增宽，可见部分硬化的肾小球,间质中有大量单个核细胞浸润表2  各组GVHD小鼠肾组织免疫组化的半定量    3  讨    论慢性GVHD LN小鼠模型是国际公认并被广泛应用的LN小

16、鼠模型，病变类似人类SLE，按WHO的LN形态学分类，LN小鼠模型主要表现为增生型肾小球损害3。本实验结果显示，自首次注射淋巴细胞后第8周开始，GVHD小鼠24h尿蛋白量逐渐升高，第12周末达到高峰，病理组织学检查发现部分肾小球硬化、肾小管萎缩以及间质大量单个核细胞浸润和基质沉积，表明我们已成功构建了GVHD LN小鼠模型。Smads蛋白是TGF的下游信号传导蛋白，目前发现脊椎动物有9种不同的Smads，根据其结构和功能不同可分为受体激活型Smad（RSmads）、通用型Smad（CoSmads）和抑制型Smad（ISmads）3个亚家族。Smad4是CoSmads，可与磷酸化的RSmads结

17、合成复合物，在Smads信号传导通路中起着信号的正向传导放大作用，Smad7是ISmads，通过竞争性地与型受体结合而抑制RSmads蛋白磷酸化和信号传导复合物的形成，起着自身负调控作用4。以往的研究均表明，Smad4对Smads信号通路依赖型靶基因的激活至关重要，它是目前在哺乳动物中发现的唯一CoSmads。Goto等6用酶联免疫吸附法比较了肾小球肾炎小鼠的肾小管间质纤维母细胞（ICGNTIFs）和正常小鼠的肾小管间质纤维母细胞(ICRTIFs)中TGF1的表达水平，结果发现TGF1的表达及其活性均没有明显差异，而诱导ICGNTIFs胞浆内Smad4蛋白表达升高后，发现细胞对TGF1的敏感性

18、显著增强，Smad2/3Smad4聚合物形成能力及核转位率也明显提高，从而增强了TGF1的信号转导。这提示当肾系膜细胞以及肾小管间质纤维母细胞中Smad4蛋白表达异常增高后，可能通过增强TGF1的信号转导从而促进肾脏纤维化。Smad7在其他肾脏疾病中的表达有学者作过研究，但结果不尽相同。Fukasawa等7在大鼠肾梗阻模型（UUO）研究中发现，随着UUO大鼠肾小管间质纤维化的进展，Smad7mRNA表达水平不断增高，而蛋白表达水平却降低，进一步研究显示，可能由于Smad的泛素调节因子1、2（Smad ubiquitin regulatory factors Smurfs），也称E3泛肽酶（E3

19、 ubiquitin ligases）表达水平增高，导致Smad7蛋白的降解和泛肽化活性显著增强。Uchica等8在肾小球膜增生性肾炎大鼠模型（antiThy1 nephritis）中发现Smad7在肾小球表达降低，但 Ostendorf等9却在相同的模型中得到了相反的结论。我们的实验结果显示，慢性GVHD LN小鼠及B组小鼠肾组织均检测到Smad4及Smad7mRNA和蛋白的表达，LN小鼠肾组织Smad蛋白及mRNA的表达均显著高于B组（P<0.05）。对我们实验结果的可能解释如下：（1）以往我们的研究10在LN肾组织中TGF的表达水平显著增高，Smad4作为TGF下游信号传导的承担者

20、，随着肾脏纤维化病程不断恶化和TGF表达增强而增强；另外，Smad7基因启动子区包含1个Smad3Smad4复合物的结合序列（GTCTAGAC），因此TGF和Smad4表达水平增强会显著上调Smad7的表达；（2）近来研究发现，Smads信号通路的抑制物（如：SnoN和Ski等）在纤维化的肾脏中表达水平降低11，提示Smads抑制物表达的降低可能是肾脏纤维化中Smads表达增高的重要机制；(3) Smad7在LN肾组织中的表达增强，但内源性Smad7的表达却不足以抑制纤维形成反应，因为TGF对内源性Smad7表达的刺激不足以克服其活化RSmads而产生的纤维化效应，对此的可能解释是Smad7表

21、达的基本水平（即使受到刺激时）能阻止RSmads介导TGF效应，这一监控形成了一个内源性Smad7表达的刺激阈值，超过这一阈值则发生纤维形成反应12，而可能通过一个适当的载体系统（如：转染Smad7基因13）使Smad7异位表达，这可能是治疗肾脏纤维化的一种手段。综上所述，在LN肾脏纤维化发生发展的分子机制中有Smads蛋白的参与，而且不同类型的Smads分子承担的作用不同，以Smads蛋白作为靶向治疗目标调节其正负向调控蛋白的平衡表达，将为LN的治疗提供新的手段。【参考文献】  1MARIE C H,DAVID A.The comparative role of activator protein1 and Smad factors in the regulating of TIMP1 and MMP1 gene expression by transforming growth factor 1J.J Biol Chem,2003,278(12):1030410313.2VITA R,LOPEZ S,ESTEBAN,et al.Angiot