单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4体外抑制白念珠菌芽管形成及粘附作用(1)

1、单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4体外抑制白念珠菌芽管形成及粘附作用(1)                   作者：陈新辉，赵明玄，安金刚，李巍，刘玉峰   【摘要】  目的：观察单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4在体外抑制白念珠菌芽管形成及抑制白念珠菌与宿主细胞粘附的作用. 方法：将不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4分别与白念珠菌酵母相悬液在有利于芽管形成的条件下共同

2、孵育，倒置显微镜下计数白念珠菌总数以及白念珠菌芽管数；将不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4与白念珠菌酵母相和人角质形成细胞混悬液、白念珠菌酵母相和人口腔黏膜上皮细胞混悬液、白念珠菌酵母相和胎儿脐静脉内皮细胞混悬液共同孵育，分别计数人角质形成细胞、人口腔黏膜上皮细胞、胎儿脐静脉内皮细胞上粘附的白念珠菌数. 结果：与对照组比较，不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4均能抑制白念珠菌芽管生成，并且抗体浓度越高，抑制白念珠菌芽管形成的作用越明显；同时单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4能够显著减少白念珠菌与角质形成细胞、上皮细胞、内皮细胞的粘附，其抑制作用与单克隆天然抗角蛋白抗体I

3、gM 3B4的浓度呈正相关. 结论：单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4在体外能够抑制白念珠菌芽管形成，能够抑制白念珠菌与人角质形成细胞、人口腔黏膜上皮细胞、胎儿脐静脉内皮细胞的粘附，从而降低白念珠菌的侵袭力，提示天然抗体IgM在机体抗真菌感染的天然免疫中可能具有积极的作用. 【关键词】  白念珠菌；单克隆抗体；免疫，天然Inhibitory effect of natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4 on germ tube formation and adhesion of Candida albicans in vitro

4、    【Abstract】 AIM: To investigate inhibitory action of a natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4 specifically against Candida albicans in vitro. METHODS: The different concentrations of natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4 were incubated with Candida albicans yeast

5、 phase suspension on condition that profited germ tube formation of Candida albicans to observe the action of natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4 to Candida albicans germ tube formation.And the different concentrations of natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4 were incubated wit

6、h the mixed suspenions of Candida albicans yeast phase with malpighian cells, human buccal epithelial cells, endothelial cells of fetal umbilical vein, respectively, to observe the action of natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4 to the adhesion of Candida albicans to malpighian cells, huma

7、n buccal epithelial cells and endothelial cells of fetal umbilical vein. RESULTS: It was found that the different concentrations of natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4 could inhibit Candida albicans germ tube formation and adhesion of Candida albicans to malpighian cells, human buccal ep

8、ithelial cells and endothelial cells of fetal umbilical vein.Its inhibitory action was positively related to the level of natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4. CONCLUSION: Natural monoclonal antikeratin antibody IgM 3B4 can inhibit the adhesion of Candida albicans to the malpighian cells,

9、 human buccal epithelial cells and endothelial cells of fetal umbilical vein, and decrease the invasion of Candida albicans due to its inhibitory action on the formation of Candida albicans germ tube,which indicates that natural antibody IgM plays a role in the natural immunity against yeast infecti

10、on.    【Keywords】 Candida albicans； monoclonal antibody；immunity，natural0引言    随着抗生素滥用、肿瘤化疗患者增多以及免疫缺陷人群的不断扩大，真菌感染的临床意义越来越重要，但是抗真菌感染的免疫应答机制尚未完全阐明. 近年来，人们逐渐认识到体液免疫在抗真菌感染中也起着重要作用，而天然体液免疫又构成了机体抵御外来感染的第一道防线，天然抗体的作用逐渐引起人们的重视，同时值得注意的是无论是临床还是动物实验均未发现口腔念珠菌感染有系统扩散的现象从而提示先天免疫系统在全身

11、抗念珠菌感染的重要地位，其中天然抗体必然起着关键的作用. 本课题组在前期工作中成功筛选到了3株(分别命名为2H8，3B4，4G2)稳定分泌天然抗角蛋白抗体的杂交瘤细胞，并发现其中一株分泌的IgM 3B4抗体具有广泛的多反应性，可以识别包括真菌、细菌、病毒成分在内的多种抗原，并且本课题组近期的研究发现正常 C57BL /6小鼠机体内存在与白念珠菌结合的以IgM型为主的天然抗体3. 我们拟通过观察IgM 3B4抗体在体外抑制白念珠菌芽管生成以及抑制白念珠菌与角质形成细胞、上皮细胞、内皮细胞之间粘附的情况，为进一步研究天然IgM 抗体在抗真菌感染中的作用机制提供实验依据.  &#

12、160; 1材料和方法    1.1材料mAb IgM 3B4，mAb IgM 4G2杂交瘤细胞株由本所建立4；白念珠菌国际标准菌株ATCC90028（第四军医大学西京医院检验科）；IgM同型对照(TEPC，Sigma公司)；角质形成细胞无血清培养基（KCSFM，Gibico公司）；RPMI 1640干粉培养基（Gibico公司）；人角质形成细胞株HaCaT (南京医科大学第一附属医院皮肤科惠赠)；人口腔黏膜上皮细胞(健康志愿者提供)；脐静脉内皮细胞细胞株ECV304(第四军医大学唐都医院核医学科惠赠)；68 wk龄SPF级BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中

13、心）；SDA平板配方(麦芽糖40 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，调pH至7.0，118灭菌15 min，倾注平板，无菌试验后备用)；SDA液体培养基配方(麦芽糖40 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 L，调pH至7.0，118灭菌15 min，无菌试验后备用)；GSB液体培养基配方葡萄糖10 g，NaH2PO4 3.5 g，(NH4)2SO4 2.5 g，MgSO4.7H2O 2.5 g，CaCl2 2.1 g，DBiotin 40 mg，氯霉素40 mg，蒸馏水1 L，调pH至7.0，118灭菌15 min，无菌试验后备用；其它试剂为本所常规贮存.  

14、60; 1.2方法    1.2.1IgM 3B4抗体抑制白念珠菌芽管形成实验5冻存条件下白念珠菌接种于SDA平板，25，24 h，然后转种于SDA液体培养基，37，24 h，再转种于GSB液体培养基，测A490 nm0.01， 25，200 r/min，48 h后收获白念珠菌酵母相. 取白念珠菌酵母相，用不完全1640培养液（pH 7.0，不含血清）调整白念珠菌酵母相浓度至5×108个/L. 将白念珠菌酵母相悬液分成5组，每组1 mL，实验组加入IgM 3B4抗体，抗体最终浓度分别为50，20，5 mg/L；对照组分为IgM同型对照(TEPC)和IgM

15、 4G2抗体，最终浓度为50 mg/L；空白对照组加入无菌生理盐水. 37，微震荡孵育1.5，3 h后分别取样，对每组样品在光学倒置显微镜下(×400)计数10个视野的全部白念珠菌以及长出芽管的白念珠菌，各取其平均值，计算芽管生成率. 芽管生成率=（带芽管的白念珠菌数目/白念珠菌总数）×100.    1.2.2IgM 3B4抗体抑制白念珠菌与相关细胞粘附取角质形成细胞无血清培养基培养扩增的HaCaT细胞经无菌生理盐水洗涤3次，调整细胞密度至1×108个/L，每组500 L. 实验组加入IgM 3B4抗体，抗体最终浓度分别为50，20，5 mg/L；对照组分为IgM同型对照(TEPC)和IgM 4G2抗体，最终浓度为50 mg/L；空白对照组加入无菌生理盐水. 白念珠菌酵母相浓度调整为5×1010个/L，取400 L与上述各组混匀， 37，微震荡孵育3 h后各组分别取样，经生理盐水洗涤3次后涂片，行革兰氏染色后对每组样品在光学显微镜(×400)下计数100个角质形成细胞上粘附