人凝血因子ⅨcDNA在C2C12细胞中的表达

1、    人凝血因子cDNA在C2C12细胞中的表达李朝霞王宏伟王宁遂卢大儒邱信芳薛京伦 【摘要】目的探索一种新的血友病B基因治疗的靶细胞。方法用两种逆转录病毒载体G1NaMC和G1NaC分别将人凝血因子cDNA转入小鼠C2C12成肌细胞中，观察凝血因子(F)cDNA表达及肌肉组织特异性增强子序列对表达的调控。结果带肌肉组织特异性增强子序列的逆转录病毒载体G1NaMC能使FcDNA在C2C12中的最高表达量24小时达640ng/106细胞，活性达90%，明显高于无增强子序列的逆转录病毒载体G1NaC的24小时380ng/106细胞的表达量。结论 成肌细胞具

2、有合成、分泌活性F的功能，可作为血友病B基因治疗的一种理想靶细胞。 【关键词】Christmas病因子，DNA，互补 The expression of human factor cDNA by C2C12 myoblasts Li Zhaoxia, Wang Hongwei, Wang Ningsui, et al. Children"s Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400014 【Abstract 】ObjectiveTo explore a new type of somatic cell for gene

3、 therapy for the inherited disorder-hemophilia B. MethodsThe C2C12 myoblasts were infected by retrovirus vectors G1NaMC and G1NaC, respectively. Then the authors observed the expression of human factor cDNA and the regulation by muscle specific enhancer. ResultsThe highest level of human factor prot

4、ein controlled by G1NaMC was 640ng/106 cells/24 hours, Significantly higher than 380 ng/106/24 hours controlled by G1NaC the biological activity was 90%. ConclusionMyoblasts can synthesize and secrete biologically active factor, and it is an ideal target cell in hemophilia B gene therapy. 【Key words

5、 】Christmas diseaseFactor DNA, complementary 血友病B是由于凝血因子(F)基因缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病。临床对症措施不能根治该病，并且病人因长期输血面临各类病毒感染，人们设想用基因治疗的方法来替代目前常规治疗方法。成肌细胞是肌肉前体细胞，一方面具有分化潜能可相互融合形成新的肌纤维1，另一方面具有分泌性2，3，在体细胞基因治疗中扮演重要角色。我们选用从C3H小鼠分离的一种保持分化能力的成肌细胞株C2C12细胞作为靶细胞，观察人凝血因子cDNA在其中的表达情况及肌肉组织特异性增强子对表达的调控。 材料和方法 一、材料 本研究所用各种限制性内切

6、酶均为美国Sigma公司产品；逆转录病毒辅助细胞株PA317购自美国ATCC公司；抗人凝血因子单克隆抗体3A6由日本奈良医学院Yoshioka博士赠送；兔抗人凝血因子抗血清及辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG抗血清购自美国Calbi ochem-Behring公司；缺乏凝血因子基质血浆由上海瑞金医院血液研究室提供；G1Na病毒框架由第一军医大学彭朝晖教授赠送；检测凝血因子cDNA引物由复旦大学遗传研究所开放实验室合成；逆转录病毒载体G1Nac由复旦大学遗传研究所基因治疗课题组构建；C2C12细胞株由美国密歇根医学中心姚寿南博士赠送；4RCAT质粒由美国加州大学医学中心Hauschka教授赠送。 二

7、、方法 1.G1 NaMC逆转录病毒载体的构建：包括碱法提质粒DNA、酶切、连接、DNA片段分离和回收、细胞转化等均按Sambrook等4方法进行。具体过程如下： 用Pvu, Hind二酶从4RCAT质粒上切下肌肉组织特异的增强子序列小鼠肌酸激酶基因(MCK)增强子片段连接到人巨细胞病毒(hCMV)- cDNA片段上游, 使MCK增强子和hCMV启动子共同调控FcDNA表达构成G1 NaMC逆转录病毒载体。鉴定时选择Xho、Sca两单一酶切位点, 消化后分别产生一条长为7.8 kb的片段。Hind为双酶切位点, 消化后产生5.5 kb和2.3 kb两条片段。正向插入者, BamH酶切, 出现0

8、.7 kb和7.1 kb两条片段。 2.细胞培养及细胞融合：逆转录病毒包装细胞PA317和小鼠成纤维细胞NIH3T3用含10%小牛血清DMEM培养液培养。C2C12细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液培养、含5%马血清的DMEM培养液使C2C12细胞融合, 72小时后形成肌纤维和肌小管。 3.DNA和病毒感染：用电穿孔法将重组质粒DNA转染PA317细胞, 逆转录病毒悬液感染C2C12细胞, 用NIH3T3细胞进行滴度测定等参照文献5进行。 4.聚合酶链反应(PCR)检测：若两种病毒载体将F cDNA转入C2C12细胞中, PCR扩增C2C12细胞的DNA，将出现183bp的阳性片段6。 5

9、.人凝血因子抗原含量的测定采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)7。 6.人凝血因子活性检测用柠檬酸钡吸附法8。 结果 人凝血因子cDNA在离体C2C12细胞中的表达： 一、PCR检测结果 均为阳性。说明G1NaMC和G1NaC两种逆转录病毒载体均已成功地将FcDNA转移到C2C12细胞中。 二、FcDNA在C2C12细胞中的表达分析(附表) 对照组为未转染FcDNA的C2C12细胞, 其F24小时表达量为0 ng/106细胞。经统计分析两逆转录病毒载体所感染的C2C12成肌细胞, 人凝血因子蛋白的表达量与对照组相比较其差异均有显著意义(t1=19,P1< 0.01；t2=12.8, P2

10、< 0.01), 两逆 附表人凝血因子在C2C12细胞中24小时的 表达量和活性(±s) 逆转录 病毒载体 例数 人凝血因子 (ng/106细胞)* 活性 (%) G1NaC 4 380±20 90 G1NaMC 4 640±50 90 *各4个表达最高克隆的平均值 转录病毒间的差异亦有显著意义(t=3.86,P< 0.05)。 三、C2C12/ G1NaC细胞和C2C12/ G1NaMC细胞分化前后人凝血因子蛋白表达比较 C2C12/ G1NaC细胞分化前F表达量为2×105细胞80ng,分化后为400 ng, 增加约5倍；C2C12/ G

11、1NaMC细胞分化前F表达量为140 ng, 分化后2×105细胞1 600 ng, 增加约11倍, 说明MCK在肌纤维和肌小管中的增强作用更显著。 讨论 血友病B是凝血因子基因缺陷而致的一种严重遗传性出血性疾病。自本世纪80年代末开展基因治疗以来, 戴一凡等9及薛京伦等10以人皮肤成纤维细胞为靶细胞取得了较满意的成果。但无论自体或异体成纤维细胞在体内均有一定寿命, 当带有正常因子cDNA的细胞衰老死亡后, 必然会影响因子的表达, 不能解决目的基因在体内长期表达的问题。而且使用该细胞需胶原包埋, 操作较繁杂。肝细胞在理论上是最理想的靶细胞, 但肝细胞是终级分化细胞, 对逆转录病毒载体

12、感染不敏感, 而且重新植入肝脏后不会再分裂, 亦不能使目的基因长期表达。国外学者Barr等2和Dhawan等3分别证明了成肌细胞具有合成、修饰、分泌血浆蛋白的功能，可作为体细胞基因治疗的靶细胞。 我们的实验结果显示：FcDNA在培养的C2C12成肌细胞中最高表达量24小时可达640 ng/106细胞，活性达90%, 与国外学者Yao等11, Dai等12的报道相似, 证实了成肌细胞确实具有合成、修饰、分泌凝血因子的功能, 符合血友病B基因治疗靶细胞的基本条件。而且还有独特的优点：(1)肌肉组织庞大，约占体重40%, 取材、回输容易, 临床应用象肌注给药一样简便易行。(2)成肌细胞进入体内一方面

13、可以相互融合成肌纤维, 而且可以与机体内的肌纤维融合, 将目的基因传递给其它纤维。(3)肌肉组织血管丰富, 蛋白很容易进入血液循环。 基因治疗成功在于外源基因高效长期表达。而高效持久表达受多种因素影响, 除了启动子外, 增强子是另一重要因素。我们新设计构建的逆转录病毒载体G1NaMC是带有肌肉组织特异的增强子序列小鼠肌肉肌酸激酶基因，长60bp，包含下列起增强子作用的核心顺序：CCCAACACCTGCTGCCT。实验证实了该序列确实起着明显增强表达的作用，尤其在肌小管中的增强作用更明显, 与Yao等11的观察一致。以上事实说明今后选择肌肉途径进行血友病B基因治疗是一种理想的方案。 作者单位：4

14、00014 重庆医科大学附属儿科医院(李朝霞、王宁遂)；上海复旦大学遗传研究所(王宏伟、卢大儒、邱信芳、薛京伦) 参考文献 1Yao SN, Kurachi K. Inplanted myoblasts not only fuse with myofibers but also survive as muscle precusor cells. J Cell Sci, 1993, 105: 957-963. 2Barr E, Leiden JM. Systemic delivery of recombinant proteins by genetically modified myoblast

15、s. Science, 1991, 254: 1507-1509. 3Dhawan J, Pan LC, Pavlath GK, et al. Systemic delivery of human growth hormone by injection of genetically engineered myoblasts. Science, 1991, 254: 1509-1512. 4Sambrook J, Fritsch EF, Marviatis T. Molecular cloning: a laboratory mannual. 2nd ed. New York: Cold Spr

16、ing Harbor Laborary Press, 1989, 46. 5周洁民, 戴一凡, 邱信芳, 等.转染人凝血因子cDNA的血友病B患者皮肤成纤维细胞在小鼠体内的高效表达. 中国科学, B辑, 1992, 35: 611-618. 6胡以平, 邱信芳, 薛京伦, 等.人凝血因子cDNA在细胞中和转基因小鼠内的表达特性. 遗传学报, 1995, 22: 161-166. 7Anson DS, Austen DE, Brownlee GG. Expression of active human clottiong factor from recombinant DNA clones in

17、 mammalian cell. Nature, 1985, 315: 683-685. 8Busby S, Kumar A, Joseph M, et al. Expression of active human factor in transfected cells. Nature, 1985, 316: 272-273. 9戴一凡, 邱信芳, 薛京伦, 等. 带有人因子cDNA的反转录病毒载体的构建及其在血友病B患者皮肤成纤维细胞中的高效转移和表达中国科学, B辑, 1990, 33: 1248-1292. 10薛京伦, 卢大儒, 周洁民, 等. 成纤维细胞基因治疗血友病B的临床I期试验中国科学, B辑, 1993, 36: 53-60. 11Yao SN, Smith KJ, Kurachi K. Primary myoblast-mediated gene transfer: persistent expression