小鼠PDL1Red2融合蛋白真核表达载体的构建、 表达及其效应

1、小鼠PDL1Red2融合蛋白真核表达载体的构建、 表达及其效应                      作者：廖雯君, 孙晶, 朱慧芬, 张金元, 沈关心 【摘要】  目的: 小鼠跨膜型PDL1与红色荧光蛋白（RFP）融合基因真核表达载体的构建、 表达与鉴定, 及其效应初步研究。方法: 应用基因工程技术构建重组载体, 脂质体转染NIT细胞株, 以流式细胞术（FCM）

2、和倒置相差荧光显微镜检测融合蛋白的表达; 采用混合淋巴细胞培养, 以FCM测定脾细胞的增殖反应。结果: 融合基因在转染的真核细胞中获得表达, 并呈膜分布, 转染PDL1/pDsRed2N1的细胞对淋巴细胞增殖反应有一定的抑制作用, 表明PDL1/pDsRed2N1融合蛋白中分子标签未影响PDL1的结构及其生物学活性。结论: PDL1与DsRed2融合基因载体构建成功, 表达的融合蛋白具有生物学活性。 【关键词】  PDL1; 红色荧光蛋白; 融合基因; 混和淋巴细胞培养    B7家族的共刺激分子无论在提供共刺激信号或抑制性信号中均起关键作用1。PDL1

3、(PD ligand1) 又称B7 DC, 是B7家族的新成员2, 主要表达在树突状细胞、 单核/巨噬细胞、 B细胞、 激活的T细胞。某些恶性肿瘤细胞系亦有表达, 可能与肿瘤免疫逃避机制相关3。PDL1既能促进T细胞增殖也能抑制T细胞活化4, 其受体为程序死亡蛋白1(programmed death 1,  PD1), 诱导性表达于T细胞表面, PD1/PD L1信号在免疫应答的负性调控中发挥重要作用5。    红色荧光蛋白（DsRed2）来源于香菇珊瑚体内, Matz等6等将原红色荧光蛋白DsRed经过点突变之后的突变体, 溶解性增强, 表达时间缩短。

4、本实验采用逆转录多聚酶链反应（RTPCR）方法, 克隆了跨膜型PDL1, 并与红色荧光蛋白融合, 构建真核表达载体pDsRed2N1/PDL1, 用脂质体转染将其导入胰岛细胞（NIT）中, 并观察其表达及其对淋巴细胞增殖影响, 为进一步研究PDL1的生物学效应及其应用奠定基础。    1  材料和方法    1.1  材料  E.coli DH5、 pDsRed2N1由华中科技大学同济医学院免疫学系保存。pMD18T质粒、 DNA marker DL 2 000均购自TaKaRa公司。小鼠胰岛细胞株（NI

5、T）, 由澳大利亚WEH实验室惠赠。3周孕龄BALB/c小鼠购自上海院动物实验中心, BALB/c小鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。限制性内切酶Sal I、 Hind ; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶, RevertAidTM first strand cDNA Synthesis kit、 dNTPs及DNA Extraction kit均为MBI公司产品。TRIzolTM Reagent kit、 LipofectamineTM2 000、 VybrantTMCFDA SE Cell Tracer kit(V12883)均购自Invitrogen公司。丝裂霉素C、

6、ConA均购自Sigma。Biotin抗鼠PDL1抗体购自eBioscience公司。streptridinAPC为BD公司产品。    1.2  方法    1.2.1  组织总RNA的提取  将BALB/c孕鼠麻醉处死后, 仰卧位, 解剖取出胎盘、 肾脏、 子宫、 心脏、 肌肉等组织, 分别置入少量液氮快速研磨。将组织转移到EP管, 采用TRIzol提取RNA, 紫光分光光度计测定其纯度和浓度, 分装后于-80中保存待用。    1.2.2  跨膜型PDL1 c

7、DNA的RTPCR扩增  根据GenBank中鼠PDL1 cDNA序列及1设计引物, 上游引物P1: 5CAAGTAGACAAGCTTCCACCATGAGGATATTTGCT3, 下游引物P2: 5CGTTCGTCGACTGCGTCTCCTCGAATTG3, 由上海英俊(Invitrogen)生命合成。以4 g RNA为模板, 以50 pmol/L下游引物P2引导, 按RevertAidTM first strand cDNA  Synthesis kit说明书合成PDL1的第1链, 反应体积20 L。取5 L逆转录反应液为模板, 加引物P1、 P2, Taq DNA聚合酶

8、等PCR扩增PDL1全长cDNA。    1.2.3  扩增片段的克隆、 筛选  将PCR产物直接连接pMD18T载体16, 水浴过夜后, 转化E.coli DH5感受态细胞。采用菌落PCR筛选接入正确外源基因的转化子PDL1/pMD18T, 以碱裂解法从阳性克隆中提取质粒, 双酶切鉴定, 用ABI3730测序仪测定序列。同时用Sal I、 Hind III 过夜酶切PDL1/pMD18T和pDsRed2N1, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收900 bp和5.7 kb片段, 用T4连接酶连接过夜, 转化E.coli DH5菌株, 从阳性克隆

9、中提取质粒进行酶切、 测序鉴定。    1.2.4  重组体pDsRed2N1/PDL1用脂质体转染至NIT细胞  取体外培养的对数生长期NIT细胞, 调整细胞的密度为3×108/L, 离心去上清。同时将pDsRed2N1和PDL1/pDsRed2N1分别加入无血清培养液, 稀释浓度为0.8 g/50L备用。按Lipofectin2000脂质体转染试剂盒提供转染程序, 将6 g pDsRed2N1和PDL1/pDsRed2N1通过溶解的脂质体转染NIT细胞。转染48 h后, 荧光显微镜下高倍镜观察细胞荧光表达, 流式细胞仪（FACSC

10、alibur）分析荧光阳性细胞百分数。    1.2.5  间接免疫荧光FCM检测转染细胞PDL1的表达  取转染pDsRed2N1或PDL1/pDsRed2N1的 NIT细胞1×109/L 100 L分别加入96孔细胞培养板中, 先后加入Biotin抗鼠PDL1抗体(0.5 g/L) 1 L , 100 L 1100稀释的 StreptavidinAPC, 洗涤、 离心, 以FCM检测PDL1蛋白的表达。    1.2.6  PDL1/pDsRed2N1转染NIT细胞对淋巴细胞刺激作用的测定&

11、#160; 小鼠脾单个核细胞作为反应细胞, 转染细胞及未转染的NIT细胞经过丝裂霉素C（终浓度为30 mg/L）处理后为刺激细胞, 加入24孔培养板中, 调节细胞密度为1×109/L, 同时加入CFDA SE使终浓度为2 mol/L; 将上述细胞悬液置37  50 mL/L CO2培养箱培养3 d。以FCM检测CFDA SE荧光强度分析淋巴细胞增殖。    2  结果    2.1  不同组织中PDL1 mRNA的表达与基因的克隆及测定  从BALB/c小鼠的胎盘、 肾脏、 肺、 肝脏

12、、 子宫、 心脏、 肌肉等组织中提取总RNA, 逆转录合成cDNA第1条链, 用针对PDL1的特异性引物, 进行PCR扩增, 各泳道可见0.9 kb基因片段, 同时以actin为内参照。扩增产物经20 g/L琼脂糖电泳。0.9 kb片段与pMD18T克隆载体连接, 连接子转化E.coli DH5。挑取阳性转化子抽提质粒, 经酶切、 PCR鉴定, 有4个质粒都已插入预计大小的外源基因片段, 序列分析证实, 所含cDNA序列为正确的PDL1基因编码区全长序列, 表明PDL1已成功克隆。凝胶电泳结果可见各泳道为900 bp左右的条带, 与PDL1基因的理论值相符, 命名为PDL1/pMD18T载体。

13、1             2.2  PDL1 /pDsRed2N1融合蛋白表达载体构建  PDL1/pMD18T和pDsRed2N1的酶切连接产物将经过序列分析, 确认含有PDL1基因的阳性细菌克隆提取质粒DNA, Sal I、 Hind III双酶切, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示5.7 kb和900 bp两条片段。表明PDL1已成功重组到真核表达载体pDsRed2N1, 命名为PDL1/pDsRed2N1。    2.3

14、0; PDL1/pDsRed2N1和pDsRed2N1在NIT细胞中的表达  pDsRed2N1和PDL1/ pDsRed2N1表达载体分别转染NIT细胞, 培养48 h后, 经倒置相差荧光显微镜观察, pDsRed2N1转染细胞可见胞质荧光（图1A）, 而PDL1/ pDsRed2N1表达载体转染的NIT细胞可见膜荧光（图1B）。表明所构建的跨膜型PDL1/pDsRed2N1表达载体通过PDL1引导序列将融合基因引至胞外, 并通过跨膜区将其固定在胞膜, 以跨膜形式表达, 且不影响红色荧光蛋白的表达, FCM测定NIT细胞转染效率为45.69%。   

15、2.4  转染NIT细胞PDL1的表达  Biotin抗鼠PDL1抗体/StreptridinAPC间接免疫荧光FCM分析结果表明转染PDL1/pDsRed2N1的细胞表达的PDL1可与抗PDL1抗体特异性结合, 未转染表达载体细胞抗体染色以及RFP的表达均为阴性(图2)。    2.5  转染PDL1对淋巴细胞增殖的影响  分别取转染PDL1/pDsRed2N1, pDsRed2N1 NIT细胞, 未转染的NIT细胞加至脾细胞悬液中, 3 d后经FCM检测CFSE荧光强度, 测定细胞增殖活性, 结果显示转染pDsRed2N

16、1组细胞增殖率50.65%（图3a）, 转染PDL1/pDsRed2N1的细胞组对同种细胞增殖率38.15%（图3b）, 未转染NIT组细胞增殖率62.31%（图3c）, 表明转染PDL1/pDsRed2N1的细胞对同种细胞刺激的增殖反应有一定的抑制作用。    3  讨论    程序性死亡分子配体1 (programmed deathligand 1, PDL1)同B7家族的其他成员一样, 成熟的PDL分子包含有Ig样区、 IgC样区、 跨膜区及一个短的胞质区尾部。在胞外区有4个保守的半胱氨酸残基, 参与Ig样结构中二硫键

17、的形成。已被证实PDL1为PD1的配体, PDL1信号在TCR激发的一定阈值时, 对T细胞的增殖及细胞因子的分泌起到负性调控作用, 对维持机体的外周耐受方面发挥重要作用7。PDL与PD1结合后,  PD1胞质区C端的酪氨酸残基磷酸化, 募集SHP2磷酸酶, 抑制Ca2+内流, 下调活化信号分子如Syk、 PI3K、 PLC、 Vav等激酶的酪氨酸磷酸化, 抑制淋巴细胞增殖8。PDL1/PD1途径在维持外周耐受中有重要作用, 活化的自身反应性T细胞可表达PD1和CTLA4而阻止其进一步分化和扩增9。外周CD8+T对自身组织成分的耐受依赖于PD1和CTLA4的协同作用, 以及PD1还可抑

18、制初始B细胞的细胞周期进程10。    本研究首先根据GenBank中的小鼠的PDL1 cDNA序列（AF327184）, 设计特异性引物, 包括一段信号肽, 以PDL1的mRNA为模板, 扩增长度为870 bp跨膜型PDL1。研究证明小鼠胎盘、 心脏、 肺、 肝脏、 子宫等组织等均表达PDL1, 其中肌肉组织表达量最低, 胎盘组织PDL1 mRNA表达量相对较高。采用RTPCR方法克隆了跨膜型PDL1并与RFP融合, 经限制性酶切图谱、 PCR及DNA序列分析证实克隆构建成功。转染后荧光显微镜观察可见跨膜分布的荧光, 表明PDL1信号肽序列和跨膜区分别将融合基因

19、引至胞外, 并固定在胞膜表达。FCM分析证明脂质体转染NIT细胞2448 h后, 红色荧光阳性率为24.62%。表明成功构建PDL1/pDsRed2N1融合基因真核表达载体, 并以跨膜形式表达, 且不影响红色荧光的表达, 抗PDL1抗体染色为阳性, 表明转染细胞表达的PDL1可与相应抗体特异性结合, 为进一步研究其生物学效应奠定了基础。    我们本研究通过转染胰岛细胞跨膜型表达PDL1, 与同种异体MHC抗原反应性T细胞和自身反应性T细胞表面的PD1结合, 有可能启动负性共刺激信号, 抑制其活化。因此, 在胰岛移植IDDM的过程中, 若使移植的胰岛细胞（胰岛）高

20、表达PDL1, 有可能抑制移植物局部浸润的同种反应性T细胞活化, 诱导同种移植耐受; 同时由于是负性共刺激分子, 可诱导自身反应性记忆T细胞克隆无能或凋亡, 对重建自身耐受具有重要意义。 【】  1 Henry J, Miller MM, Pontarotti P. Structure and evolution of the extended B7 familyJ. Immunol Today, 1999, 20(6): 285-288. 2 Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH. The B7 family revisitedJ. An

21、nu Rev Immunol, 2005, 23: 515-548. 3 Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumorassociated B7H1 promotes Tcell apoptosis: a potential mechanism of immune evasionJ. Nat Med, 2002, 8(8): 793-800. 4 Zang X, Loke P, Kim J, et al. B7x: a widely expressed B7 family member that inhibits T cell activationJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(18): 10388-10392. 5 Zhang X, Schwartz JC, Guo X, et al. Structural and fu