增龄对体外培养的兔角膜缘干细胞增殖能力的影响(1)

1、【摘要】目的观察增龄对新西兰兔角膜缘干细胞体外生长、增殖的影响。方法用酶消化法将不同年龄新西兰兔角膜缘组织制成细胞悬液,以相同的细胞密度种植,观察体外培养的角膜缘干细胞的生长情况,细胞免疫荧光染色鉴定,四甲基偶氮唑蓝(MTT 法检测其增殖活性,流式细胞术检测细胞周期。结果2个月龄组新西兰兔角膜缘干细胞的增殖活性和增殖期细胞所占比例均较1.5年龄组和3年龄组高。结论角膜缘干细胞的增殖能力随着年龄的增加而降低。【关键词】干细胞;角膜缘;增龄;细胞增殖角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs 是位于角膜缘基底层的一类特殊类型的上皮细胞。正常情况下角膜缘干细胞增殖、分化形成角膜上皮细

2、胞,以取代表层衰老死亡的细胞;同时它还具有上皮屏障作用,能阻止结膜上皮及血管向角膜内生长。角膜缘干细胞缺乏将导致各种眼表功能异常。随着细胞培养技术的发展,角膜缘干细胞体外培养后移植用于治疗由于角膜缘干细胞缺乏或者功能不全引起的眼表疾病已成为研究的热点。由于对角膜缘干细胞增殖、分化、迁移的影响因素认识还不完全,体外培养后处于增殖期的未分化的干细胞数量还不能保证,有可能会导致角膜缘干细胞移植的失败1。因此,对角膜缘干细胞增殖、分化、迁移的影响因素的研究就显得非常重要,本实验探讨了年龄对体外培养的新西兰兔角膜缘干细胞增殖能力的影响,总结如下。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物:健康无眼疾的新西

3、兰大白兔15只,雌雄不限,按年龄分为2个月龄组、1.5年龄组和3年龄组,每组动物数为5只。1.1.2主要试剂:DMEM/F12培养液购自Gibco 公司;胎牛血清(FBS 购自杭州四季青公司;Dispase 购自Roche 公司;重组人表皮生长因子(EGF 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF 购自Peprotech 公司;胰岛素、多聚赖氨酸、四甲基偶氮唑蓝(MTT 购自Sigma 公司;氢化可的松为Solarbio 进口分装;鼠抗兔角蛋白K3抗体(AE5购自Chemicon 公司;鼠抗人p63抗体(4A4、FITC 标记的山羊抗小鼠荧光二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2方法1.2.1

4、角膜缘干细胞的分离与培养:动物麻醉后,侧卧位固定。青霉素、链霉素双抗水冲洗结膜囊,眼周碘伏消毒。铺手术洞巾,眼球表面麻醉。沿角膜缘环形剪开球结膜和结膜下筋膜后,环形剪取角膜缘外1mm 、角膜缘和角膜缘内2mm 的角膜上皮组织(深约150m 。将其置于1.2U/ml 的Dispase 中消化2h ,剥离上皮层。用吸管反复吹打、离散细胞。1000r/min 离心5min ,收集细胞。细胞计数板下计数总细胞数,加培养液(DMEM/F12+10%FBS ,5g/ml 胰岛素,0.5g/ml 氢化可的松,20ng/ml EGF ,10ng/mlbFGF 制成细胞数为2×104/ml 的细胞悬液

5、。锥虫蓝测定细胞活性后,接种于用多聚赖氨酸处理的培养瓶,置CO 2培养箱中37培养。增龄对体外培养的兔角膜缘干细胞增殖能力的影响于花马蕾基金项目:山西省卫生厅科技攻关基金资助项目(200706作者单位:030001太原,山西医科大学第二医院眼科通讯作者:马蕾Effects of aging on the proliferation of in-vitro cultured limbal stem cells from rabbits YU Hua,MA Lei.De-partment of Ophthalmology,Second Hospital of Shanxi Medical Univ

6、ersity,Taiyuan 030001,China【Abstract 】Objective To investigate the effects of aging on the proliferation of in-vitro cultured limbal stemcells (LSCsfrom New Zealand rabbits.Methods Limbal epithelium harvested from New Zealand rabbits of different ages were enzymatically cleft into single cell suspen

7、sion and seeded at a same cell density.The growth status of LSCs was observed,with the use of immunofluorescence to identify cell proliferation,MTT to assess the proliferative capacity and flow cytometry to determine the cell cycle.Results The proliferative capacity of LSCs and percentage of prolife

8、 rating cells were the highest in the 2-month-old group compared with the 1.5-year-old and 3-year-old groups.Con-clusion The proliferation capacity of limbal stem cells was shown to decrease with aging.【Key words 】Stem cell ;Limbus corneae ;Aging ;Cell proliferation1.2.2免疫荧光染色鉴定:第二代细胞接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片上

9、,70%融合后取出,4%多聚甲醛固定,0.3%Triton×100破膜,5%牛血清白蛋白(BSA封闭30min,一抗在湿盒中4过夜,次日加入荧光标记的二抗孵育1.5h,90%甘油封片。1.2.3角膜缘干细胞生长周期的检测:有丝分裂选择法获取M期的同步化细胞,接种于六孔板。细胞达80%融合时收集,70%的酒精种固定2h,RNA酶处理30min,加入10mg/ml的碘化丙啶4避光染色30min,流式细胞仪488nm检测。1.2.4角膜缘干细胞增殖能力的测定:原代细胞70%80%融合后消化传代,以细胞浓度为1.5×104/ml 接种于96孔板,加入培养液,于17d每天用MTT 法

10、测量角膜缘干细胞的增殖能力,用分光光度计测定波长595m的吸光度值(A。以时间(d为横坐标,A值的细胞相对值为纵坐标,绘制各年龄段生长曲线。1.3统计学处理实验数据以x±s表示,多个样本均数比较用方差分析,多重比较用SNK-q检验。2结果2.1体外培养的角膜缘干细胞的生长特性:原代培养的细胞贴壁较慢,接种3d大部分细胞贴壁,可见细胞单个散在或三五个聚集在一起生长。培养6d 左右,即可达到80%90%融合。原代培养的细胞可见3种形态:一种是圆形、椭圆形,类似基底的柱状细胞;一种是多边形,类似翼状细胞;还有一种细胞呈大而扁平状,类似表层上皮细胞。2个月龄组细胞贴壁后,形态较小,以圆形、椭

11、圆形和多边形为主,形成的集落较大(图1。1.5年龄组和3年龄组细胞较大,呈散在分布,部分细胞可见丝状骨架结构。局部细胞密集处可见典型的上皮“拉网”现象。形成集落较慢较小(图2。传代后2个月龄组角膜缘干细胞约1h后贴壁,第2天即开始增殖,较1.5年龄组和3年龄组贴壁早,潜伏期短。2.2免疫荧光染色结果:第二代角膜缘干细胞部分p63表达阳性(细胞质绿染(图3,部分角蛋白K3表达阳性(细胞质绿染(图4。2.3角膜缘干细胞生长周期比较:3个年龄组各周期所占比例见表1。2个月龄组增殖期(S+G2+M细胞比例明显高于其他组,与1.5年龄组和3年龄组比较差异均具有统计学意义。3年龄组增殖期细胞比例较1.5年

12、龄组减小,但差异无统计学意义。可以认为随着年龄的增加,增殖期细胞比例呈现减小的趋势。2.4角膜缘干细胞的增殖能力及生长曲线:3个年龄组的第二代细胞生长曲线见图5。由图可见,角膜缘干细胞的对数增殖期大约在第36天,之后增殖缓慢,进入生长平台期。各年龄组年龄越小其达到峰值的时间越早。2个月龄组与1.5年龄组(q=6.03,P< 0.01以及2个月龄组与3年龄组(q=5.75,P<0.01峰值相比差异均具有统计学意义;1.5年龄组与3年龄组之间的差异无统计学意义(q=0.28,P>0.05。3讨论角膜上皮具有保护眼球,稳定泪膜,维持角膜透明性等功能,其完整性的维持依赖于表浅细胞不断

13、脱落和基底层角膜缘干细胞不断增殖分化取代脱落细胞来实现2。作为角膜上皮细胞增殖的储备力量, LSCs不仅可以分化、增殖为上皮细胞,维持角膜上皮细胞数目的平衡;更重要的是,它像一道屏障,阻止结膜上皮细胞和新生血管移行至角膜表面,这对于保持角膜的透明性与正常生理功能具有重要意义3。迄今为止,尚未发现角膜缘干细胞特异的标志物。本实验选取目前比较公认高表达的p634作为其阳性标记,角蛋白K35作为其阴性标记进行鉴定。许多细胞的增殖能力在发育的不同阶段明显不同。Komiyama和Suzuki6比较了从出生后330d小鼠中分离的雪旺细胞增殖情况,发现年轻鼠的雪旺细胞胸苷摄入明显大于老龄鼠,而且融合所需要的

14、时间也短,说明随着鼠龄的增大,细胞的增殖能力下降。本研究细胞周期中,随着年龄的增大,增殖期S+ G2+M细胞的百分比例减少,静止期比例增加,表明细胞的增殖能力随着年龄的增加而下降。活细胞线表1不同年龄新西兰兔LSCs细胞周期所占比例(%(x±s组别G0+G1S G2+M S+G2+M2个月龄组58±538.0±2.63.5±1.042±4ab1.5年龄组73±712.2±2.714.9±4.127±63年龄组80±47.2±1.312.8±4.020±5注:a与1.

15、5年龄组比较q=4.01,P<0.05;b与3年龄组比较q= 5.99, P<0.01粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为蓝色甲眃颗粒,且生成量与活细胞数量及细胞活化状态呈线性关系7。二甲基亚砜能溶解颗粒,用酶联免疫检测仪测定其吸收值,可间接反映活细胞数量与功能。从MTT生长曲线可以看出2个月龄组与3年龄组的差异有统计学意义,表明3年龄组增殖能力和活性较弱。可见,随着年龄的增加,角膜缘干细胞的增殖能力和活性相应减弱。这或许是老年患者角膜上皮损伤后愈合缓慢的原因之一。细胞衰老是细胞内部结构的衰变,细胞生理功能的衰退和丧失,和细胞的寿命密切相关。Hayflick 8报道,在同一动

16、物中由于个体健康情况及年龄的差异,体外成纤维细胞的培养寿命不同。例如人胚胎成纤维细胞可传5060代,出生后至15岁可培养2040代,而15岁以后则仅能传1030代,早老症患者成纤维细胞只能在体外传210代。这些说明,体外培养的二倍体细胞的增殖能力反映了它们在体内的衰老状况。本研究通过对三个年龄组新西兰兔角膜缘干细胞的体外培养、比较,发现随着年龄的增长,其增殖能力下降,呈现老化的趋势。(本文图1-4见插页第5-1页参考文献1Dunnwald M,Tomanek-chalkley A,Alexandrunas D,et al.Iso-lating a pure population of epid

17、ermal stem cells for use in tissue engineering.Exp Dermatol,2001,10:45-54.2Kruse FE.Stem cells and corneal epithelial regeneration.Eye, 1994,8:170-183.3Sangwan VS.Limbal stem cells in health and disease.Biosci Rep,2001,21(4:385-405.4Arpitha NV,Prajna M,Srinivasan M,et al.High expression of p63combin

18、ed with a large N/C ratio defines a subset of human limbal epithelial cells:implications on epithelial stem cells.In-vest Ophthalmol Vis Sci,2005,46:3631-3636.5Chen Z,De Paiva CS,Luo L,et al.Characterization of putative stem cell phenotype in human limbal epithelia.Stem Cells,2004, 22:355-366.6Komiyama A,Suzuki K.Age-related changes in attachment and proliferation of mouse Schwann cells in vitro.Dev Brain Res, 1991,62(1:7-19.7Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and sur-vival:application to proliferation and cytotoxicity assays.Immunol Methods,1983,65:55-63.8Hayflick