大鼠急性脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的超微结构与血清S100B蛋

1、大鼠急性脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的超微结构与血清S100B蛋作者：吴松笛，万琪，夏峰，耿晓英，刘学东，王津存【关键词】 血脑屏障Dynamic changes of bloodbrain barrier permeability and S100B protein level in serum after acute cerebral ischemia/reperfusion in rats【Abstract】 AIM: To investigate the dynamic changes of the bloodbrain barrier（BBB） permeability and th

2、e S100B protein level in serum after acute cerebral ischemia/reperfusion in rats. METHODS: The middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) rat model was made by the thread occlusion method; the permeability of BBB was investigated by transmission electron microscope using lanthanum nitrate

3、 as the tracer; the serum S100B protein concentrations were determined by ELISA at 0.5, 2, 6, 12, 24 and 48 h reperfusion after 2 h cerebral ischemia. RESULTS: Electron microscopy revealed that lanthanum granules appeared around the tight junction and in the endotheliocytes at 0.5 h areperfusion, in

4、dicating the increase of BBB permeability. More phagotrophic lanthanum granules were found in the endotheliocytes that showed significant vacuolization at 2 and 6 h. The tight junction was opened and the astrocytes were separated from the basement membrane of the capillaries. The necrosis of both ne

5、urons and astrocytes with dissolved nucleus and the disruption of the capillary basement membrane were found at 12 and 24 h. The necrosis and disaggregation of many neurons and astrocytes were evident at 48 h. A lot of lanthanum granules were shown outside the brain vessels while many endotheliocyte

6、s were broken. The serum S100B protein level increased significantly only in rats after cerebral ischemia/reperfusion injury, but not in the shamoperation and the nonoperation control rats (P0.01). The serum concentration of S100B protein started to increase at 0.5 h of reperfusion. It kept at a hig

7、h level until a peak appeared at 24 h. The serum S100B protein was maintained at a high level constitutively even at 48 h. CONCLUSION: The dynamic change of the S100B protein level in serum after ischemia/reperfusion reflects the change of the permeability of BBB. S100B can therefore be used as a pe

8、ripheral biochemical marker to assess the permeability of BBB.【Keywords】 bloodbrain barrier; brain ischemia; reperfusion; S100B protein【摘要】 目的： 研究大鼠急性脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的超微结构与血清S100B蛋白水平的动态变化. 方法： 采用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞再灌注动物模型；硝酸镧示踪电镜观察血脑屏障通透性；采用ELISA方法检测血清S100B蛋白，观察其分别在脑缺血2 h再灌注0.5， 2， 6， 12， 24， 48 h时的变化. 结果

9、： 硝酸镧示踪电镜结果表明，再灌注0.5 1234下一页 h，镧颗粒出现在紧密连接处；再灌注2 h和6 h，血管内皮细胞空泡化明显，星型胶质细胞的足突与毛细血管基底膜开始分离；再灌注12 h和24 h，许多神经细胞和胶质细胞变性坏死，细胞核溶解，毛细血管基底膜的连续性受到破坏；再灌注48 h，大量的神经细胞和胶质细胞坏死、崩解，多数血管内皮细胞形态不完整. 大鼠缺血再灌注后各组血清S100B蛋白水平与假手术组及对照组相比都明显升高，差异有显著性意义(P0.01). 再灌注0.5 h，血清S100B蛋白开始增高；再灌注2 h和6 h，血清S100B蛋白处较高水平；再灌注12 h和24 h，血清S

10、100B蛋白明显增高；再灌注48 h，血清S100B蛋白仍处较高水平. 结论： 脑缺血再灌注后血脑屏障通透性发生显著变化，血清S100B蛋白水平在脑缺血再灌注后的动态改变可较好的反映血脑屏障通透性的变化. 【关键词】 血脑屏障；脑缺血；再灌注；S100B蛋白0引言脑缺血再灌注损伤使血脑屏障(bloodbrain barrier, BBB)的结构和功能发生了改变，这种神经组织结构和功能的变化是缺血后病理生理改变的重要环节，也是影响药物治疗效果的关键因素之一. Nicola等1综合分析多项研究结果后发现，S100B蛋白在血脑屏障损伤后的外周血中有明显的时间变化规律，并且与血脑屏障开放程度相关，提出

11、S100B蛋白可作为反映血脑屏障损伤的外周生化标志物的理论. 为此，我们采用硝酸镧示踪电镜观察大鼠缺血再灌注后不同时间点血脑屏障通透性的改变和脑组织超微形态学变化；同时用ELISA方法检测血清S100B蛋白的动态变化，希望通过观察脑缺血再灌注后大鼠血清S100B蛋白与血脑屏障通透性的改变，来了解缺血再灌注后血脑屏障的动态变化过程.1材料和方法1.1材料成年健康雄性SD大鼠48只，体质量250300 g，由第四军医大学实验动物研究中心提供. 利用随机数字表将大鼠分为手术组(36只)、假手术组(6只)和对照组(6只)，其中手术组根据再灌注时间不同分为脑缺血2 h再灌注0.5，2，6，12，24，4

12、8 h组，每组6只. JEM2000EX透射电镜（日本电子），检测大鼠血清S100B蛋白的ELISA试剂盒（第四军医大学生理学教研室）.1.2方法1.2.1动物模型的建立参照Longa线栓改良法2，制作大脑中动脉阻塞再灌注（MCAO/R）模型. 用10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉、颈总动脉，于颈总动脉分叉下方剪一小口，将预先包被硅胶的4.0单丝尼龙缝线经该切口顺颈总动脉插入颈内动脉约(181) mm，将大脑中动脉起始部阻塞，2 h后将栓线拔出，恢复再灌注. 术后左侧上肢屈曲、行走左转或左侧跌倒者；开颅取脑时无蛛

13、网膜下腔出血者视为手术成功. 假手术组条件同上，但不线栓仅结扎右侧颈外动脉和颈总动脉.1.2.2血脑屏障通透性的超微结构参照文献3的方法. 取电镜标本方法：手术组大鼠在各固定的再灌注时间点、假手术组在结扎动脉后2 h，分别用10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，经左心室灌注生理盐水60 mL，然后再灌注镧醛固定液50 mL，迅速开颅取脑. 将整脑自视交叉向后冠状切成约1 mm厚脑片，分别于缺血侧及缺血对侧相应部位皮质及底节区各取2小块脑组织，约1.0 mm1.0 mm1.0 mm，镧醛固定液固定组织. 电镜标本由第四军医大学电镜中心制备完成后，透射电镜观察. 1.2.3S100B蛋

14、白检测将手术组大鼠在各固定再灌注时间点、假手术组在结扎动脉后2 h，分别用10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，经股动脉抽血1 mL，全部标本在30 min内离心，分离出的血清立即放入-20冰箱保存待测. 检测操作完全按照说明书进行.统计学处理： 血清S100B蛋白检测结果用xs表示，统计分析采用SPSS11.5软件中的KruskalWallis H 检验，两两比较采用Nemenyi法手工检验.2结果2.1血脑屏障通透性超微结构的变化对照组、假手术组和手术组非缺血区脑组织血管内皮细胞形态和内皮细胞间紧密连接正常，未见镧颗粒. 再灌注0.5 h，缺血区脑组织轻度肿胀，毛细血管周围的星

15、型胶质细胞的足突轻度肿胀，但仍与毛细血管基底膜紧密相连；血管内皮细胞轻度肿胀，胞质内线粒体数量开始增多，可见镧颗粒出现在紧密连接处. 再灌注2 h和6 h，缺血区脑组织肿胀明显加重，星型胶质细胞的足突与毛细血管基底膜开始分离，间隙明显扩大；血管内皮细胞肿胀更加明显，空泡化明显，胞质内含有吞噬的镧颗粒；神经纤维微管排列紊乱，镧颗粒进入细胞间隙. 再灌注12 h和24 h，缺血区脑组织上述现象更加明显，结构疏松，许多神经细胞和胶质细胞变性坏死，细胞核溶解，细胞内出现镧颗粒；毛细血管基底膜的连续性受到破坏. 大量的镧颗粒漏出血管外进入脑实质. 再灌注48 h，缺血区脑组织正常形态结构基本消失，大量的

16、神经细胞和胶质细胞坏死、崩解，并可见脑组织中大量的小胶质细胞，其胞质内充满吞噬的脂滴和其他坏死组织，形成类似泡沫细胞；多数血管内皮细胞形态不完整，内皮细胞皱缩，胞质电子密度增高，并可见胞质内有髓样体. 硝酸镧示踪电镜观察血脑屏障通透性超微结构的变化见图1. 2.2各组血清S100B蛋白检测对照组与假手术组血清S100B蛋白分别是（0.030.02）和（0.030.01）g/L，缺血再灌注各组（再灌注0.5， 2， 6， 12， 24， 48 h）血清S100B蛋白分别是（0.600.22），（0.440.17），（0.440.上一页1234下一页 13），（0.940.34），（1.010.3

17、6），（0.410.14）g/L. 缺血再灌注各组血清S100B蛋白水平与假手术组和对照组相比都明显增高，差异有统计学意义(P0.01).3讨论我们通过硝酸示踪电镜技术，观察到缺血区脑组织血脑屏障通透性的动态改变与缺血后再灌注的时间密切相关. 再灌注0.5 h，血脑屏障的紧密连接开放；再灌注2 h和6 h，血管内皮细胞空泡化明显，胞质内含有吞噬的镧颗粒，说明此阶段内皮细胞膜通透性开始增大；星型胶质细胞的足突与毛细血管基底膜开始分离，镧颗粒沉积在明显扩大的细胞间隙；再灌注12 h和24 h，由于血脑屏障的各组成结构均发生了严重损害，因此可观察到此阶段大量的镧颗粒漏出血管外进入脑实质. 再灌注48

18、 h，缺血区多数血管内皮细胞形态不完整，大量的神经细胞和胶质细胞坏死、崩解；并可见脑组织中大量的小胶质细胞，其胞质内充满吞噬的脂滴和其他坏死组织，形成类似泡沫细胞，提示组织的修复已经开始.A：正常血脑屏障；B：再灌注0.5 h；C：再灌注6 h；D：再灌注24 h；E：再灌注48 h. 图1硝酸镧示踪电镜观察血脑屏障通透性结果（略）通过使用ELISA检测方法，我们观察到血清中的S100B蛋白水平在脑缺血再灌注损伤后出现了动态变化，并且发现这种动态变化过程，与本次实验中硝酸镧示踪电镜技术观察到的血脑屏障通透性的动态改变基本相符. 即在再灌注0.5 h血脑屏障通透性发生改变时血清S100B蛋白就开

19、始增高；在再灌注212 h血脑屏障通透性逐渐增加时血清S100B蛋白维持在较高水平，并在再灌注24 h血脑屏障损伤最严重的时候达到最高值；当再灌注48 h血脑屏障损伤高峰过后组织修复时S100B蛋白开始下降. 我们观察到的这种血清S100B蛋白水平在缺血再灌注后的动态变化过程，也与Rosenberg等4采用测量脑组织中14C蔗糖的方法以及王社军等5采用伊文氏蓝定量法研究MCAO/R大鼠缺血2 h再灌注后血脑屏障通透性发生的动态变化结果相符合，上述两项实验均发现血脑屏障通透性在再灌注24 h内逐渐增加至高峰，并在再灌注48 h后开始逐渐减小.在哺乳动物，S100B蛋白特异性地表达在中枢神经系统神

20、经胶质细胞的胞质和突起，因而被认为是脑特异性蛋白. 在正常的大脑，复杂的转录机制精确地调控了S100B蛋白的表达水平；而完整的血脑屏障结构又使其正常情况下只出现在脑脊液，血中水平极低. 当神经系统疾病影响到血脑屏障的结构与功能，S100B蛋白才可以通过受损的血脑屏障进入血液，血浆浓度明显增高6. 因此，被认为是反映血脑屏障损害比较特异和敏感的指标7.本次实验发现S100B蛋白在脑缺血再灌注后的动态变化可较好地反映血脑屏障通透性的改变及再灌注脑损伤，并且检测方便无创伤性、价格经济. 新近对S100B蛋白在脑血管疾病的临床研究也发现，血中S100B蛋白浓度与脑梗死体积、神经功能缺损评分有关，血清S

21、100B蛋白的动态变化，可用于辅助诊断和判断预后8-9.【参考文献】1 Nicola M, Marco C, Vincent F, et al. Peripheral markers of bloodbrain barrier damageJ. Clin Chim Acta,2004,342(1):1-12.2 张巍,万琪,王洪典,等. 大鼠局灶性脑缺血再灌注早期非嘌呤非嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1表达的研究J. 中华老年心脑血管病杂志,2001,3(5):344-346.3 王爽,李学荣,王晓峰. 用硝酸镧示踪测定大鼠脑损伤后血脑屏障通透性改变的电镜技术J. 第四军医大学学报,1999,2

22、0(2):171-172.4 Rosenberg GA, Estrada EY, Dencoff JE. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with bloodbrain barrier opening after reperfusion in rat brainJ. Stroke,1998,29(10):2189-2195. 5 王社军,蒋传路,康军,等. 大鼠脑缺血/再灌注后血脑屏障通透性的改变及转移生长因子1的表达J.中华神经外科杂志,2003,19(1):51-54.6 Rothermundt M,Peters M,Prehn JH, et al. S100B in brain damage and neurodegenerationJ. Microsc Res Tech, 2003,60(6):614-621.7 Kanner AA, Marchi N, Fazio V, et al. Serum S100beta