心肌肌钙蛋白I与AMI诊断及其检测方法研究综述(2)-

1、心肌肌钙蛋白I 与AMI 诊断及其检测方法研究综述*尹焕才唐玉国王弼陡程文播王心醉孙海旋(苏州生物医学工程技术研究所江苏苏州215163摘要:心肌肌钙蛋白I (cTnI 是一种仅存在于心肌细胞中,骨骼肌内含量是极低的蛋白。当心肌损伤发生时,cTnI 能够快速释放进入血液,4-6h 即可检测出浓度的上升,12-24h 浓度达到峰值,并可以以较高浓度的形式在血液内维持6-8天,故诊断窗口期较长。用于急性心肌梗死(AMI 的诊断时,其特异性和灵敏度均高于其它血清标记物,已经替代了CK-MB 成为诊断AMI 的"金标准",具有重要的临床研究价值。本文就cTnI 蛋白在急性心肌梗死诊

2、断中的应用及其临床检测方法作以简要综述。关键词:心肌肌钙蛋白I ;急性心肌梗死;血清标志物中图分类号:R542.22,R446文献标识码:A 文章编号:1673-6273(201019-3782-04Detection of cardiac troponin I in acute myocardial infarction*YIN Huan-cai,TANG Yu-guo ,WANG Bi-dou,CHENG Wen-bo,WANG Xin-zui,SUN Hai-xuan (Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology,S

3、uzhou215163,Jiangsu,ChinaABSTRACT:Cardiac troponin I is unique to cardiac muscle and is not found in skeletal muscle.Following an acute myocardial in-jury,cTnI release into the blood,and rises within 4to 6hours,and peaks at 12to24hours.It remains elevated for about 6-8days,and provides a wide diagno

4、stic window.The specificity and sensitivity of this maker is higher than that of other commonly used analytes for AMI such as CK-MB and myoglobin.It replaces the CK-MB and becomes the gold standard for diagnositic of AMI ,and have important clinical research value.This review makes a general descrip

5、tion of cardiac troponin I on the diagnositic of AMI and advances on its de-tective method.Key words:Cardiac troponin I;Acute myocardial infraction;Serum maker Chinese Library Classification(CLC:R542.22,R446Document code:A Article ID:1673-6273(201019-3782-04*基金项目:苏州生物医学工程技术研究所青年引导基金项目(O92201S090作者简介

6、:尹焕才(1982-,男,硕士,主要研究方向:微生物与免疫学通讯作者:唐玉国,博士生导师,电话:0512-*(收稿日期:2010-06-24接受日期:2010-07-16前言急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction 是临床上一种突发性,高死亡率疾病,是中老年人猝死的主要病因。其发病时常伴有胸痛、恶心、发热、心律失常,血清标志物浓度升高等一系列症状,如能及早确诊并介入治疗,对挽救濒死心肌、改善预后、降低急性期病死率等具有重要意义。心肌肌钙蛋白I 是一种仅存在于心肌细胞中的特殊的蛋白质,外周血中含量极少。当发生心肌损伤时,心肌细胞破裂,心肌肌钙蛋白I 释放并进入血液循环

7、系统。当心肌损伤发生6h 后,使用cTnI 作为判断心肌损伤的血清标志物,其特异性在96%以上1-2,对急性心肌梗死的临床诊断具有重要研究价值。配合Myo (myoglobin 、CK-MB (简称心肌三项,对心肌损伤诊断其有效率达100%3。以下将对cTnI 与急性心肌梗死的诊断,及其临床检测方法作以简要综述。1心肌肌钙蛋白I 的结构与生物学特性肌钙蛋白(troponin ,Tn 是肌肉收缩的重要调节蛋白,含有三个亚单位分别是:肌钙蛋白I (Inhibitory componet,TnI ,肌钙蛋白T (Tropomyosin binding componet,TnT 和肌钙蛋白C (Cal

8、cium binding componet,TnC 。其中,肌钙蛋白I 是肌动蛋白的抑制亚基,在无钙离子存在的情况下,可与组成细肌丝的肌动蛋白相互作用,抑制肌球蛋白的ATPase 活性。TnI 存在三种不同的亚型,快骨骼肌亚型、慢骨骼肌亚型和心肌亚型,分别被三种不同的基因所编码4。其中心肌亚型肌钙蛋白即为心肌肌钙蛋白(cTnI ,基因全长约6.2Kb ,由8个外显子组成。肌钙蛋白I 心肌亚型与骨骼肌亚型间序列不同源性达40%以上,主要区别在于由1、2、3位外显子所编码的N 端,该段基因可编码47个氨基酸,较骨骼肌亚型相应N 端多26个氨基酸,其基因序列特异性较高。cTnI 全蛋白由205个氨基

9、酸组成,相对分子量约为24Kd ,是一种富含螺旋的蛋白5,蛋白质结构中含有五个螺旋区域,呈伸展式构型。Ferrieres 6等人利用68条重叠的、可以覆盖cTnI 全长序列的合成肽进行抗原表位作图,研究cTnI 抗原性的特点后发现,合成肽均具有抗原性。并且N 末端和C 末端的抗原性最强。该蛋白表面含有两个半胱氨酸残基,易被氧化或还原;而表面的两个丝氨酸残基,又易受到体内蛋白激酶A 的磷酸化,使cTnI 分子构型改变。因此,由心肌细胞释放至血液中后,cTnI到底以何种分子形式存在一直是讨论的焦点。2心肌肌钙蛋白与AMI诊断心血管疾病是人类健康的冷血杀手。WHO调查统计数据显示,2004年有171

10、0万人死于心血管疾病,预计到2030年这个数字将增加至2360万,其主要死因是心脏病和中风。数年来,临床工作者一直致力于寻找最适的AMI诊断方法。WHO 将有胸部不适史、心电图改变和血液心肌标志物浓度暂时性变化作为诊断AMI的三条标准。其中,单一使用心电图判断AMI 其阳性检出率仅有40%-60%2。因此,血清标志物浓度的改变成为急诊科医生用于确诊胸痛病人是否发生AMI的最后诊断方法。作为一种理想的心肌损伤血清标记物需要符合以下几个特点2:首先,具有较好的心肌特异性。即心肌组织中含量较高,其他组织中含量低,甚至为零;其次,释放速度快。当心梗发生后能快速释放进入血液中。可检测浓度能在血清中维持较

11、长时间(诊断窗口期时间长,且血清中的浓度高低与心肌受损程度存在一定相关性;最后,检测方法快速、简便、成本低。CK-Mass、CK-MB、Myo等均可以作为AMI的诊断血清标志物,其中CK-MB一度被认为是诊断AMI的金标准。随着对cTnI研究的深入,无论是心肌的特异性还是诊断敏感性, CK-MB的地位均受到严峻的挑战,正逐步取代CK-MB成为AMI的诊断"金标准"7。当心肌损伤发生后心肌细胞破裂,原本包含于心肌细胞内的cTnI被释放进入血液中,4-6h后血清中浓度逐渐升高,并在12-24h达到峰值,而后浓度略有降低并维持7天左右,诊断窗口期较长,6-8天后其浓度回归为正常值

12、。使用cTnI作为心肌损伤标记物与传统的CK-MB和myo相比具有以下两个明显特征8:(1特异性高,诊断窗口期时间长。早期血液内浓度变化与CK-MB相似。然而,后者24h后血清浓度即趋于正常值,无法与可维持较高浓度4-9天的cTnI相比,更无法完成中晚期心梗病人的诊断。(2cTnI和CK-MB无法替代myo,后者在心肌损伤后可立即检测到浓度的变化,在心肌损伤早期诊断方面具有不可替代的作用9。除可用于急性心肌梗死的诊断外,cTnI还用于不稳定性心绞痛10-11、急性冠状动脉综合征12-13、急/慢性心包炎14-16、围手术期心脏并发症17-18等的临床诊断以及术后评价,是心血管疾病相关诊断的一个

13、重要依据。3心肌肌钙蛋白的临床检测方法Cummins等人早在1987年即建立了心肌肌钙蛋白的放射性免疫检测方法,最低检出限为10g/L。随着技术的发展,检测方法不断更新,80年代中期建立了Elisa检测法,使用基于单克隆抗体的双抗体夹心法代替了基于多克隆抗体的竞争法,使其灵敏度和检测限得到了较大幅度的提升19。随后又在Elisa 法的基础上又发展了化学发光法,该方法的优点是试剂安全无毒,分析速度快,背景低,近年来发展十分迅速。各大医院、健康体检中心和疾控中心等通常使用检测工作站进行cTnI的检测,例如,Roche、强生、Beckman Coulter公司的Access分析系统等,并且配备有相应

14、的检测试剂盒出售。其仪器设备价格较高,适用于大量样本的集中检测。对于一些小型乡镇医院和社区卫生医疗机构就诊的胸痛病人而言,其需求多为疾病筛查,用于指导性就医。因此,小型便携式诊断设备即可满足其需求。近年来,床旁诊断设备(point of care testing,POCT逐步兴起,小型、便携式快速诊断设备发展迅速。例如胶体金法快速诊断试纸、家用血糖仪、便携式免疫分析仪、尿液分析仪及试纸等,已经逐渐深入基层卫生医疗机构和家庭。这些医疗设备的应用缩短了样品检测过程中的样品周转时间(Turnaround time,TAT,十分有利于如AMI等突发性、高致死率疾病的早期诊断。目前,使用心肌肌钙蛋白作为

15、标志物,用于心血管疾病诊断的POCT设备详细情况见表18,20:以上所列仪器均包含常用的心肌肌钙蛋白I检测,分析结果可在10min左右得出。目前,针对cTnI的检测发展了胶体金快速诊断试纸,不需要配套检测仪器,通过肉眼的判断即可完成结果判读。化学发光免疫分析法是近几年逐渐兴起的一种检测方法,主要包括直接化学发光、电致发光等。与胶体金快速诊断试纸相比,化学发光免疫分析法其检测限更低,检测范围更宽,并且对环境的污染小,配合相应的检测仪器消除了人为读数误差,在今后快速诊断类仪器的研发中必将发挥重要作用。4展望心肌肌钙蛋白I作为良好的心肌标志物已被广大临床检验工作者接受,欧洲社会心脏联盟(the Eu

16、ropean Society of Car-diology,ESC、美国心脏病学会(the American College of Cardi-ology,ACC、美国心脏协会(the American Heart Association, AHA和国际临床生化学会等(the National Academy of Clinical Biochemistry,NACB均已将cTnI检测作为判断心肌梗死的重要标准之一21-22。目前,在cTnI临床检测方面几乎全部应用单克隆抗体。临床应用中发现,这些临床检测试剂测定值间存在一定差异。不同的cTnI试剂对同一份标本的检测值最大可相差30余倍,不利于

17、AMI的诊断和预后评估,给临床应用与评价带来了一定的干扰。检测试剂间的差异主要在于使用的单克隆抗体所识别的抗原表位之间存在差异。有的抗体仅识别游离cTnI,而有的抗体识别的是以TnC-cTnI复合物形式存在的cTnI23-24。并且cTnI自身含有两个半胱氨酸和两个丝氨酸的结构特性可使其在进入血液循环后能够以氧化、还原、磷酸化、双磷酸化等多种形式存在,进而改变了cTnI的分子结构形式,为抗体识别与检验带来困扰25。目前,已经有部分研究开始试图通过cTnI最适抗原表位寻找的方法获得高特异性和敏感性的抗体8。我们有理由相信,随着对cTnI体内释放机理的深入研究、释放形式与复合物结构的精确解析,进而

18、通过对抗体识别表位的不断调整与优化,cTnI的检测必然会更加准确。这种不同试剂间的差异也会逐渐缩小,以便为临床提供更加科学、可靠的信息。众所周知,胸痛是急性心肌梗死的早期症状之一。在我国医疗条件较匮乏的农村等基层卫生医疗机构由于缺乏必要的检验设备,急性心肌梗死的死亡率较高。因此,开发适合基层卫生医疗机构的心肌损伤筛查设备,进而用于指导性就医与术后评价具有重要意义。符合POCT的cTnI检测设备为基层卫生医疗机构的胸痛病人AMI筛查提供了良好的途径。相信随着电化学、化学发光免疫分析等技术的发展,包括cTnI在内的免疫学检测项目,可以发展的如手持式血糖仪一样走进基层卫生医疗机构甚至千家万户。Not

19、e:ND-not defined.表1商业化的心肌标志物POCT检测仪器Table1Some commercially available cardiac marker point-of-care(POCtestsAssay Assay type Specimen Time(minAssay range(ng.mL-1Analytical sensitivity (ng.mL-1Stratus誖CS STAT (Dade Behring IncBench top two-siteimmunometric assayHeparinised plasma15CK-MB:0-150Myoglobin

20、:0-900cTnI:0-50CK-MB:0.3Myoglobin:1cTnI:0.03i-STAT誖(AbbottHandheld two-siteimmunometric assayWhole bloodor plasma10cTnI:0-50cTnI:0.02Triage誖Cardiac Panel(BiositeBench topflow-throughimmunometric assayPlasma or EDTAwhole blood10-15CK-MB:NDMyoglobin:NDcTnI:0.04-50BNP:NDCK-MB:1Myoglobin:5cTnI:0.05BNP:0

21、.02RAMP誖(Response Biomedical CorpBench top lateralflow immunoassayEDTA whole blood8-15CK-MB:NDMyoglobin:NDcTnI:0.03-32CK-MB:7.2Myoglobin:100cTnI:0.2Cardiac Reader TM(RocheBench toplateral flowimmunoassay150L heparinisedwhole blood812812Myoglobin:30-700cTnT:0.1-2D-Dimer:100-4000NT-proBNP:0.06-3Myoglo

22、bin:70cTnT:0.1D-Dimer:500NT-proBNP:Acute HF-0.3or Chronic HF-0.125PATHFAST誖(Mitsubishi Chemical Europe GmbHBench topchemiluminescentanalyserWhole blood orHeparin/EDTA/citrate plasma17CK-MB:2-500Myoglobin:5-1000cTnI:0.02-50D-Dimer:5-5000NT-pro-BNP:0.015-30hsCRP:50-30,000CK-MB:2Myoglobin:5cTnI:0.02D-D

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