抗PML-RARα反义核酸对NB4细胞生长、细胞周期及细胞凋亡的影响

1、    抗PML-RAR反义核酸对NB4细胞生长、细胞周期及细胞凋亡的影响        摘要目的： 探讨抗PML-RAR反义核酸对早幼粒白血病细胞生长、细胞周期、细胞凋亡的作用。方法： 以NB4细胞株为研究对象；细胞计数采用台盼兰排除、计数板计数法；白血病细胞集落采用甲基纤维素半固体培养；流式细胞仪(FCM)用于检测细胞凋亡和细胞周期。结果： 以60 g/ml的终浓度处理细胞，抗PML-RAR融合部位反义核酸（FUAS）能明显抑制NB4细胞增殖及白血病细胞集落(AML-CF

2、U)形成，最大抑制率分别为46.8%，51.6%；GM-CSF能减弱FUAS的作用，FUAS作用时间越短，GM-CSF促AML-CFU增加越明显；FUAS处理第7，9天，出现明显的凋亡细胞群，凋亡细胞百分比分别为41.0%，34.2%；FUAS处理第5天S期下降，G2/M期升高,第7天G0/G1期明显升高，S期回升。结论： 抗PML-RAR反义核酸具有抑制早幼粒白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。关键词急性早幼粒细胞白血病； 细胞凋亡； 细胞周期； 反义核酸； PML-RAR融合基因中国书资料分类法分类号R733.7; Q28Effects of PML-RAR Antisence on th

3、e Growth， Cell Cycle and Apoptosis of NB4 CellsChen Ye，Miao Jinming，Zhu Xuehong，Shao Nianxian，Fang Zhiwen，Ouyan Rengrong(Shanghai Institute of Hematology, Renji Hospital. Laboratory of Leukemia Research, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001)AbstractObjective： To investigate the effect

4、s of PML-RAR antisense on the growth，cell cycle and apoptosis of NB4 cells. Methods： Cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry, and leukemic colony forming unit was exammed by methylcellulose assays. Results： PML-RAR antisence （FUAS） could inhibited the growth, and formation of a

5、cute myelocytic leukemia colony forming unit （AML-CFU）in NB4 cells； GM-CSF could enhance AML-CFU formation and antagonized the effect of FUAS on AML-CFU formation inhibition. The shorter the time of incubation with FUAS was, the more markedly GM-CSF enhanced the AML-CFU formation. At 7 days, 9 days

6、of treatment with FUAS percentage of apoptotic cells was 41.5%, 34.2% respectively. Reduction of S phase and increase of G2/M phase at 5 days, significant increase of G0/G1 phase with S phase at 7 days. Conclusion: PML-RAR antisence can inhibit the cell growth and induce cell apoptosis of NB4 cells.

7、Key words acute promyelocytic leukemia； apoptosis； cell cycle; antisence； PML-RAR fusion gene反义核酸(AS)不仅是一种有价值的体内研究基因功能的工具，而且可作为治疗剂抑制基因表达。AS具有下调癌基因表达的潜能，且毒性低，为某些恶性肿瘤的治疗打开了一条新的治疗途径。NB4细胞株是从复发的早幼粒细胞白血病(APL)病人分离出而建株，具有典型的t(15;17)易位，并表达PML-RAR融合蛋白，在全反式维甲酸（ATRA）诱导下可分化为成熟的粒细胞。本文以NB4细胞株为模型，采用针对PML-RAR融合部位的反

8、义核酸，研究NB4细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期的改变，探讨AS治疗APL的可能性。1材料与方法1.1细胞培养及细胞计数NB4细胞株由上海血液学研究所陈竺所长提供。细胞悬浮生长于RPMI 1640培养液(购自GIBCO公司),内含15小牛血清(购自上海第二医科大学分部，56灭活30 min)、1 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠及100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素，于37，5%CO2湿空气中培养。融合部位反义寡核苷酸(FUAS)的序列为：5CTCAATGGCTGCCTCCCC 3;正义寡核苷酸(Sen)的序列为：5GGGGAGGCAGCCATTGAG 3；随机寡核苷酸(

9、Ran)的序列为：5GAAGGGCTTTTGAACTCT 3；后两者作为对照组。所有寡核苷酸的碱基均进行硫化修饰，实验分为FUAS，Sen，Ran，空白对照组共4组。各种寡核苷酸以60 g/ml的终浓度加入初始浓度为0.5×105个细胞/ml中孵育，18 h后追加寡核苷酸初始剂量的一半剂量，于孵育后不同时间收集细胞，用台盼兰排除、计数板进行计数。1.2白血病细胞集落(AML-CFU)生长于寡核苷酸处理后不同时间收集细胞，进行甲基纤维素(FlukaAG,Chemische Fabrik CH-9470 Buchs)半固体培养。各组分别加或不加GM-CSF(每皿250 ng,Scheri

10、ng-Plough Co, Ireland赠送),37，5%CO2恒温湿培养7 d，倒置显微镜下计数集落(判断标准：>40个细胞的细胞团为集落)。1.3流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期收集培养细胞5×105，用冷的PBS洗2次；加入70%冰无水乙醇固定，置-20保存至少24 h以上；测试当天，取以上固定细胞，离心2 000 r/min 5 min，用PBS洗2次；细胞悬浮于1 ml PBS缓冲液中，加1RNA酶100 l，混匀，加入含Tritonx-100的碘化丙啶(Propidium Iodide,PI, 50 g/ml)染料，PI的终浓度为25 g/ml，低温30

11、 min，过滤后上机(FACScan,FCM,Becton Dickinson USA)检测。所有资料经Lysys 软件、Celfit软件收集、储存和分析。2结果2.1抗PML-RAR反义核酸对NB4细胞生长及白血病细胞集落(AML-CFU)生成的影响FUAS能抑制NB4细胞株增殖，处理后2，3，4，5，6 d，FUAS的抑制率分别为43.8%(P<0.01)，42.9%(P<0.01)，46.8%(P<0.01)，43.8%(P<0.01)，15.4%(P<0.05)，对照组Sen，Ran无抑制作用，细胞计数与空白对照组无明显差异(P>0.05,见1)。3

12、种寡核苷酸处理后,Sen组, Ran组NB4细胞的AML-CFU数与空白对照组无明显差异（P>0.05),FUAS的AML-CFU形成明显减少(P<0.01)。处理后24，48，72，96，120 h，AML-CFU分别减少30.8%，39.15%，45.35%，51.6%，45.6%。为了了解GM-CSF对FUAS作用的影响，分别在其作用后24，48，72，96，120 h加GM-CSF，结果见2。空白对照+GM-CSF组较未用GM-CSF组AML-CFU明显增多，平均增加43.28%（P<0.01)，Sen+GM-CSF组、Ran+GM-CSF组与空白对照+GM-CSF组

13、无明显差异(P>0.05)；FUAS+GM-CSF组较未用前有一定的增加，但增加的程度没有空白对照组显著。处理后24，48，72，96，120 h，AML-CFU分别增加33.3%，32.2%，25.1%，21.5%，31.02%（P<0.05);FUAS作用时间越短，GM-CSF促AML-CFU增加越明显。（见2）。1三种寡核苷酸对NB4细胞增殖的抑制作用(n=3)Fig.1Effect of oligodeoxynucleotides on the growthof NB4 cells2GM-CSF对FUAS，Sen，Ran作用的影响(n=3)Fig. 2Effect of G

14、M-CSF on FUAS, Sen, Ran-treatedNB4 cells2.2抗PML-RA反义核酸作用后NB4细胞凋亡及细胞周期的动态变化三种寡核苷酸(60 g/ml)处理的NB4细胞株，用FCM分析细胞内DNA含量的变化。结果显示，空白对照组为正常的二倍体峰；Sen，Ran组未见峰型的改变；FUAS处理第7，9天，出现明显的凋亡细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰。FUAS处理后3，5，7，9 d的凋亡细胞百分比，分别为9.3%(P=0.05),24.5%(P<0.01), 41.0%(P<0.01)，34.2%(P<0.01)。寡核苷酸处理后的NB4细胞周期，Sen

15、，Ran组与空白对照组无明显差异。FUAS组第3天无变化;第5天S期明显下降，由对照组的45.63%下降至29.3，G2/M期则相反，由16.59%升至39.2%;第7天G2/M期下降(5.6%)，G0/G1期明显升高(54.7%)，S期回升(44.75%); 第9天基本正常。2.3抗PML-RAR反义核酸作用后NB4细胞凋亡与细胞周期改变的关系从3可看出，FUAS处理后，G2/M欺逐渐升高，第5天达高峰;第7天见较多的凋亡细胞，伴G2/M期细胞下降，G0/G1期细胞相对增加；G0/G1期细胞在AS处理后3，5 d均无改变，但第7天明显升高伴凋亡细胞增加；细胞凋亡数与S期细胞无明显关系。3FU

16、AS处理后NB4细胞凋亡与细胞周期的关系(n=3)Fig.3The correlation between apoptosis and cell cycle inFUAS-treated NB4 cells3讨论众多的实验研究间接表明，PML-RAR基因以阻断细胞分化和细胞凋亡的双重效应参与APL的发病。针对融合基因的FUAS能明显抑制NB4细胞的增殖和AML-CFU形成，提示PML-RAR基因阻断后，细胞即出现生长阻滞。APL细胞PML-RAR基因的表达大大超过野生型PML和RAR表达。PML-RAR融合蛋白扣押或阻断了残存正常的PML，RAR蛋白的功能，异常PML-RAR融合蛋白的减少则可

17、解除其显性负效应1,2，推测FUAS阻断PML-RAR融合基因表达，使PML-RAR融合蛋白合成减少，进而产生抑制效应。本文采用FUAS直接阻断PML-RAR基因的表达，结果表明，PML-RAR基因产物干扰了NB4细胞株的正常生长周期和分化功能。GM-CSF是一种造血生长因子，与特异性膜受体结合后，促进正常骨髓和单核-巨噬祖细胞的增殖和分化。一般情况下，急性髓细胞性白血病(AML)祖细胞的生存与增殖也需要造血生长因子。本文研究结果表明，GM-CSF减弱了FUAS的抑制克隆形成作用。FUAS处理时间越短，GM-CSF对其拮抗作用越强。因为正常情况下，APL细胞、NB4细胞株表达高亲和力的GM-C

18、SF受体，但APL病人血清中或NB4细胞株培养上清液中并无GM-CSF存在，一旦存在外源性GM-CSF，就能促使其增殖3。本实验中发现，FUAS作用后，NB4细胞第3天仍未见凋亡细胞；第5天细胞呈现分化现象（资料未显示），伴少量凋亡细胞；第7，9天有较多的凋亡细胞。表明PML-RAR基因阻断后，细胞进入的是分化后发生凋亡的分化成熟依赖型凋亡途径，PML-RAR基因表达不仅阻断细胞的分化程序，而且阻断细胞分化后凋亡程序。近年来，随着FCM的广泛应用，发现细胞对凋亡的敏感性与细胞株的细胞周期有关。例如ATRA诱导成神经细胞瘤细胞株G1期细胞积聚并产生凋亡，而顺钋诱导G2/M期细胞积聚和凋亡4；拓扑

19、异构酶抑制剂camptothecin诱导S期细胞凋亡5；未分化的HL60细胞S期对凋亡敏感6。本文发现，FUAS组NB4细胞株S期下降，G2/M期逐渐升高，当细胞出现明显凋亡时，G2/M期细胞急骤下降，G1/G0期升高，提示FUAS引起NB4细胞株的G2/M期阻滞，对凋亡的敏感性较高，随着细胞凋亡的发生，G2/M期细胞减少，G1/G0期细胞相对升高。有关APL细胞周期，目前报道不多。Brooks等报道，RAR选择性结合物和RXR选择性结合物能引起NB4细胞株分化及细胞生长阻滞，细胞阻滞在细胞周期的各个控制点，而非G1期7。Bocchia报道，ATRA诱导APL分化时，伴G1期生长阻滞8。本文A

20、S作用后，G2/M期阻滞，其确切的意义尚待进一步研究。针对PML-RAR融合基因的AS能抑制NB4细胞增殖和白血病细胞克隆形成、促进细胞分化、诱导细胞凋亡，提示FUAS具有从分子水平抗肿瘤细胞增殖的效应，与维甲酸合用可能提高疗效。陈烨（上海第二医科大学附属仁济医院血液科上海血液学研究所白血病研究室上海200001）缪金明（上海第二医科大学附属仁济医院血液科上海血液学研究所白血病研究室上海200001）朱学宏（上海第二医科大学附属仁济医院血液科上海血液学研究所白血病研究室上海200001）邵念贤（上海第二医科大学附属仁济医院血液科上海血液学研究所白血病研究室上海200001）方智雯（上海第二医科

21、大学附属仁济医院血液科上海血液学研究所白血病研究室上海200001）欧阳仁荣（上海第二医科大学附属仁济医院血液科上海血液学研究所白血病研究室上海200001）参 考 文 献1，Yoshida H, Kitamura K,Tanaka K,et al. Accelerated degradation of PML-retinoic acid receptor (PML-RAR) oncoprotein by all-trans retinoic acid in acute promyelocytic leukemia: Possible role of the proteasome pathwa

22、y. Cancer Res, 1996, 56(1)： 29452，Raelson J, Nervi C, Rosenauer A， et al. The PML/RAR oncoprotein is a direct molecular target of retonoic acid in acute promyelocytic leukemia cells. Blood, 1996, 88(8): 28263，de Gentille Alban, Schlageter MH, Krawice I,et al. Donnees actuelles sur les recepteurs du GM-CSF dans les leucemies aigues myeloids. Bull Cancer, 1992, 79: 1234，Piacentini M, Fesus L, Melino G. Multiple cell cycle access to the apoptotic death programme in human neuroblastoma cells. FEBS Lett, 1993, 320: 1505，Go