抗PML-RARα反义核酸的设计、合成和对NB4细胞生长、凋亡的影响

1、    抗PML-RAR反义核酸的设计、合成和 对NB4细胞生长、凋亡的影响        【摘要】目的合成针对长型PML-RAR融合基因mRNA起始部位和融合位点的反义核酸(AS)，探讨AS的稳定性、特异性及其对NB4细胞生长、凋亡的影响。方法以NB4细胞株为研究对象，采用台盼蓝拒染法进行细胞计数；聚丙烯酰胺凝胶进行寡核苷酸的电泳；流式细胞仪、DNA电泳、细胞荧光染色进行细胞凋亡检测。结果合成的AS稳定、耐细胞内外核酸酶、无非特异性作用；起始部位AS（STAS)和

2、融合位点AS(FUAS)明显抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性。浓度20g/ml时增殖抑制率0%11.3%；80g/ml时，抑制率50.0%67.7%。FUAS（60g/ml）处理第7天、第9天出现明显的凋亡细胞群，处理后3天、5天、7天、9天的凋亡细胞率分别为9.3%、24.5%、41.0%、34.2%。结论针对长型PML-RAR融合基因的AS设计、合成是成功的；抗PML-RAR AS能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。【关键词】基因,PML-RAR细胞系，NB4寡核苷酸，反义 Design and synthesis of anti-PML-RAR antisense and its effects

3、on the growth and apoptosis of NB4 cellsCHEN Ye, MIAO Jinming, ZHU Xuehong，et al. Shanghai Institute of Hematology, Laboratory of Leukemia Research,Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai200001【Abstract】ObjectiveTo synthesize antisense oligodeoxynucleotides (AS) targeting the fu

4、sion point region (FUAS) and the start codon region (STAS) of the long type PML-RAR mRNA and investigate its stability, specificity and effects on the growth and apoptosis of NB4 cells. MethodsNB4 cell apoptosis was assayed by flow cytometry, cell-fluorescence and DNA gel electrophoresis. Trypan blu

5、e exclusion was used for cell counts, and polyacrylamide gel electrophoresis for oligodeoxynucleotides. ResultsThe synthesized 18bp phosphorothioate oligodeoxynucleotides was stable, resistant to nuclease, and no unspecific effects. Both STAS and FUAS could inhibit the NB4 cell growth in a dose-depe

6、ndent manner. Low concentration (20g/ml) of STAS or FUAS resulted in growth inhibition of 0%11.3%， and the highest inhibition was found at concentration of 80g/ml (inhibition rate 50.0%67.7%). Cell DNA content analyzed by flow cytometry showed the typical profile of apoptotic cells at 7th day, 9th d

7、ay of treatment with FUAS. Percentages of apoptotic cells in FUAS-treated cells was 9.3%, 24.5%, 41.0% and 34.2% after 3,5,7 and 9 days of FUAS treatment, respectively. ConclusionSTAS and FUAS successfully synthesized and both of them could inhibit the growth and induce the cell apoptosis of NB4 cel

8、ls.【Key words】Genes, PML-RARCell line, NB4Oligonucleotides, antisense反义核酸(antisence，AS)技术是通过反义寡核苷酸与靶基因结合来达到抑制癌基因表达的目的。AS的互补链可以是基因 DNA或mRNA。目前报道的体内外实验都是首选 mRNA。针对mRNA最常见的靶序列是翻译起始部位及附近的密码子或融合基因的融合位点密码子。急性早幼粒细胞白血病（APL)有t(15;17)，产生的特征性PML-RAR融合基因为AS技术的建立提供了一个理想的范例。t(15;17)中，17号染色体的断裂点总是出现在 RAR基因的第2个内含子1

9、,2，15号染色体的断裂点则可能出现在PML基因的3个不同区域，即第6内含子(bcr-1)、第3内含子(bcr-3)、第6外显子(bcr-2)，相应的PML-RAR蛋白可分为长型(L型)、短型(S型)和变异型三种。NB4细胞株cDNA序列3与长型PML-RAR cDNA一致,因此，我们采用针对长型PML-RAR mRNA的反义寡核苷酸进行研究。材料和方法1AS的设计和合成根据AS设计的原则，选择长型PML-RAR mRNA的翻译起始部位和融合位点作为靶位点合成AS。起始部位反义寡核苷酸(STAS)、融合部位反义寡核苷酸(FUAS)，分别与PML-RAR cDNA起始部位和融合部位序列互补，另设

10、正义链寡核苷酸(Sen,序列与融合部位序列cDNA一致)、随机寡核苷酸(Ran)作为对照组。所有实验均分为STAS、FUAS、Sen、Ran、空白对照共5组。寡核苷酸合成序列如下：STAS序列：5-GGTCTCGGGAGGCAT-3；FUAS序列：5-CTCAATGGCTGCCTCCCC-3；Sen序列：5-GGGGAGGCAGCCATTGAG-3；Ran序列：5-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3。所有寡核苷酸均由Sangon公司用PE公司391型DNA合成仪合成，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。寡核苷酸的碱基均进行硫化修饰，即寡核苷酸磷酸二酯键内非连接氧被硫替代。2寡核苷酸配

11、制寡核苷酸用不含小牛血清的RPMI 1640培养液溶解，浓度为1g/ml,临用前配制或配制后置-20低温保存。3细胞培养NB4细胞株由上海血液学研究所陈竺教授提供。细胞悬浮生长于RPMI 1640培养液(购自Gibco公司)中，内含体积分数为15的小牛血清(56灭活30分钟，购自上海第二医科大学分部)、1mmol/L谷胺酰胺、1mmol/L丙酮酸及青霉素和链霉素各100U/ml，于37、体积分数为5的CO2湿空气中培养。以初始细胞浓度为0.5×105/ml的培养液接种于96孔板，每孔加含细胞的培养液0.2ml，分别将4种寡核苷酸以20，30，40，60，80g/ml 5种不同终浓度加

12、入NB4细胞培养液中，孵育18小时后再追加初始浓度的一半剂量，同时设空白对照，即不加任何寡核苷酸作用的NB4细胞培养物。于孵育后第2，3，4，5，6天收集细胞进行检测。4细胞计数采用台盼蓝拒染、计数板计数法。5变性PAGE聚丙烯酰胺凝胶浓度为16g/L，用于寡核苷酸电泳。6细胞DNA电泳用常规酚-氯仿抽提法抽提DNA，20g/L琼脂糖上样电泳，电压80V，3小时,溴化乙锭(EB)染色，紫外反射透色仪观察，照相。7流式细胞仪(FCM)检测收集培养细胞5×105，用冷的PBS洗2次；加入冰无水乙醇固定，边加边摇，乙醇的终浓度控制在体积分数70左右，-20保存至少24小时；测试当天，取上述

13、-20保存的固定细胞，2000r/min离心5分钟，用 PBS洗2次；细胞悬浮于1ml PBS缓冲液中，加10g/L RNA酶100l，混匀，室温放置10分钟；加入含Triton X-100的碘化丙锭(PI， 50mg/ml)，PI的终浓度为25mg/ml，低温30分钟，过滤后上机(FACScan,Becton Dickinson, USA)检测。所有资料经 Lysys软件、Celfit软件收集、储存和分析。8细胞荧光染色检测取寡核苷酸处理过的NB4细胞培养液25l，加1l荧光染色液（由3种DNA荧光染料CO，CY，CN制成，美国李彪如教授赠送）混匀；取10l混合物置载玻片上，盖上盖玻片。于荧

14、光显微镜下观察并计数 200个以上细胞，计数凋亡细胞百分率。判断标准：活细胞为绿色，凋亡细胞为橙红色，坏死细胞为均匀淡红色。结 果1寡核苷酸的稳定性将4种寡核苷酸溶解于无BSA的RPMI 1640培养液中，取少量-20保存5个月，然后进行变性PAGE。低温存放5个月的寡核苷酸溶液与临用前配制的无差异，提示硫代磷酸型寡核苷酸在RPMI 1640培养液中能完全溶解，低温放置较长时间也未见降解。为了解硫代磷酸型寡核苷酸在血清中的稳定性，4种寡核苷酸分别与含体积分数为10的小牛血清的RPMI 1640培养液(终浓度200g/ml)孵育72小时，取10l进行变性PAGE，结果表明硫代磷酸型寡核苷酸在血清

15、中相当稳定。2不同浓度AS对NB4细胞生长的影响用不同浓度STAS、FUAS、Sen、Ran处理NB4细胞，结果提示Sen组、Ran组对细胞的生长几乎无影响，高浓度(80g/ml)时，对细胞的增殖有轻度(0%18.6%)的抑制作用(见1)；STAS组、FUAS组明显抑制细胞增殖，低浓度(20g/ml)时STAS组、FUAS组对细胞的生长抑制率为0%11.3%, 80g/ml时STAS组、FUAS组对细胞增殖的抑制作用最强，最大抑制率分别为67.7%和59.2%，抑制作用从第2天即出现，第4天达高峰。60g/ml时STAS组、FUAS组对细胞增殖的最大抑制率分别为58.9%和46.8%，但Sen

16、组、Ran组的细胞增殖情况与空白对照组无明显差异。    14种寡核苷酸对NB4细胞株生长的抑制作用(n=3)3抗PML-RAR AS处理后NB4细胞内DNA含量的变化及细胞凋亡的检测60g/ml寡核苷酸处理的NB4细胞株，用 FCM分析细胞内DNA含量的变化。结果显示空白对照组为正常的二倍体峰； Sen、Ran组未见峰型的改变；FUAS处理后第7天、第9天出现明显的凋亡细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰。凋亡细胞峰的百分率基本上代表在总的细胞中发生凋亡的细胞百分率。FUAS处理后第3，5，7，9天的凋亡细胞百分率分别为9.3%，24.5%，41.0%，3

17、4.2%。荧光染色检测的凋亡细胞百分率与FCM检测结果基本一致(见表1)。表1寡核苷酸处理后不同时间FCM及荧光染色检测的凋亡细胞百分率寡核苷酸3天(%)5天(%)7天(%)9天(%)FCMYGRYGRFCMFCMYGRFCMYGRFUAS9.86.024.59.041.032.034.225.0Sen3.52.04.21.06.00.75.31.0Ran5.10.54.90.67.21.06.50.8空白对照3.20.33.61.04.11.03.00.2     注：YGR为荧光染色检测4抗PML-RAR AS处理后NB4细胞DNA降解的检测寡核苷酸

18、处理后不同时间NB4细胞株的DNA电泳结果见2。FUAS处理后第3，5，9天未见梯状条带，第 7天有可疑的梯状条带出现。讨论成功的AS设计和合成是进行反义技术的先决条件。理想的AS应仅与互补的靶序列特异性结合，不抑制其它相关或不相关的基因。AS的特异性取决于AS的结构和序列。根据统计，人类基因组中AS最短长度为1115bp的寡核苷酸，17bp的AS能发现特异性的靶序列；AS的组成是影响特异性的另一个因素，GC比例过高增加非特异性结合， <"0602 (5281 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317180423173&q

19、uot; 186 119>M：Marker;15：第7天；610：第9天；排列顺序分别为空白对照、FUAS、Sen、STAS、Ran组2STAS、FUAS处理后第7，9天NB4细胞的DNA电泳结果反之，AT比例过高则影响AS与靶序列的结合；温度、离子强度也都影响mRNA与寡核苷酸的特异性结合4。此外，AS与mRNA单链形成RNA-DNA双链杂交体是AS产生生理效应的基础。因此，合适的AS应尽可能短，但又得足以与mRNA形成稳定的复合物。Gambacorti-Passerini等5合成针对PML-RAR基因DNA和cDNA融合部位的15bp核酸多肽(PNA)，结果发现PNA能与DNA、mR

20、NA稳定结合，抑制聚合酶链反应，但体外不能抑制mRNA的翻译，而针对PML-RAR起始部位和多聚嘌呤区域的PNA,则能特异性抑制其体外的翻译和转录，说明以PML-RAR融合基因的融合位点作为靶序列存在一定的困难。我们选用PML-RAR起始部位、融合位点的密码子作为靶序列，合成18bp的AS。结果表明：针对这两个部位的AS都能抑制NB4细胞增殖，提示设计的AS长短合适，能与mRNA形成稳定的杂交体，且有序列特异性作用。未修饰的寡核苷酸很易被存在于细胞内外的核酸酶降解，我们采用细胞培养和体内应用最多的硫代磷酸型反义寡核苷酸，并经PAGE纯化。变性PAGE结果表明，硫代磷酸型反义寡核苷酸能溶解于无血

21、清的RPMI 1640培养液中，并能低温放置较长的时间，在含56灭活血清培养液中也能稳定存在，证明硫代修饰型寡核苷酸具有耐细胞内外核酸酶的作用。STAS组和FUAS组对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性。浓度为20g/ml时，增殖抑制作用弱(抑制率0%11.3%),持续时间短；80g/ml时，抑制作用强(抑制率50.067.7%)，且持续时间长。Sen组和Ran组浓度为80g/ml时，显示轻度的细胞增殖抑制作用，可能与硫代磷酸型寡核苷酸的非特异性作用有关。硫可与血清或细胞内多种蛋白质结合，产生毒性作用，一般通过减少寡核苷酸的用量，可避免其非特异性抑制作用。寡核苷酸浓度为60g/ml时，STAS组、

22、FUAS组的细胞抑制作用略低于80g/ml，但Sen组、Ran组无明显抑制作用，排除了寡核苷酸的非特异性抑制作用。因此，我们选择60g/ml为最佳工作浓度，同时说明本研究的AS设计是成功的，符合AS的基本要求。细胞凋亡是许多体细胞的正常归宿，特别在造血系统，凋亡是造血细胞终末分化的一个基本组成部分。细胞凋亡明显受抑是造成白血病细胞大量积聚的主要原因。Bruel等6认为，维甲酸诱导的细胞分化与死亡是两个独立的过程，即维甲酸诱导后细胞或进入分化程序或进入凋亡程序，但两个过程又相互联系，进入分化后的细胞最终通过凋亡被清除。我们在实验中发现，FUAS作用后NB4细胞株第 3天仍未见凋亡细胞；第5天细胞

23、呈现分化现象(资料未显)，伴少量凋亡细胞；第7天、第9天有较多的凋亡细胞。细胞形态可见典型的凋亡小体，FCM呈亚二倍体峰，荧光染色见到橙红色的凋亡细胞，表明PML-RAR被阻断后，细胞进入分化后发生凋亡的分化成熟依赖型凋亡途径。因此， PML-RAR表达不仅阻断细胞的分化程序，而且阻断细胞分化后凋亡程序。本文结果中DNA电泳无典型的DNA梯形条带，可能与抽提DNA的细胞总数较少或本身方法不够敏感或凋亡细胞数比例不高有关。抗PML-RAR AS抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，直接证明PML-RAR融合基因是导致APL发生的根本原因，并为今后应用AS治疗APL提供了实验依据。本课题受国家自然科学基金(

24、39590291)资助作者单位：200001上海第二医科大学附属仁济医院白血病实验室、上海血液学研究所陈烨(现在南通医学院附属医院血液科)、缪金明、朱学宏、邵念贤、方智雯、欧阳仁荣参考文献1Chen SJ, Zhu YJ, Tong JH,et al.Rearrangement in the second intron of the RAR gene are present in a large majority of patients with acute promyelocytic leukemia and are used as molecular marker for retinoid

25、 acid induced leukemia all differentiation.Blood,1991,78:2696.2Diverio D,lo Coco F , DAdamo F,et al. Identification of DNA rearrangements at the retinoic acid receptor-alpha (RAR-alpha) locus in all patients with acute promyelocytic leukemia (APL) and mapping of APL breakpoints within the RAR-alpha second intron.Italian Cooperative Study Group “GIMEMA". Blood,1992，79:3331-3336.3de The H, Lavan C, Marchio A,et al. The PM