微生物来源的具有促进纤溶作用的低分子化合物的研究进展(1)-找论

1、微生物来源的具有促进纤溶作用的低分子化合物的研究进展(1)-找论        【摘要】  归纳了纤溶酶原的空间结构和纤溶酶原的活化在血栓溶解上的重要作用，分析了低分子化合物通过改变纤溶酶原空间结构促进血栓溶解的机理。重点叙述了到目前为止发现的complestatin,chloropeptin ,stablabin,sarfuctin,glucosyldiacylglycerol等几类具有促进纤溶作用的低分子天然化合物和它们各自的特性，并且叙述了这些化合物促进纤溶作用的机制。   &#

2、160; 【关键词】  纤溶酶原；纤溶作用；低分了化合物        Review of low molecular weight compounds from the microbial metabolites that enhancing fibrinolysis      【Abstract】  The paper introduces fibrinolytic system,structure and activation of plasminogen with e

3、mphasis on the low molecular biosubstances found up to now and discussing their mechanism of enhancing fibrinolysis.     【Key words】  plasminogen;fibrinolysis;low molecular weight compounds     纤溶系统（纤溶酶原/纤溶酶系统）具有溶解血栓的作用，此外它还与创伤治疗、组织再建、血管新生、炎症反应、排卵、癌的形成与转移、动脉硬化、病原菌的

4、组织侵入等许多生理的、病理的变化过程相关1，2，纤维蛋白原是血液中的重要构成蛋白质，正常血浆的含量在24g/L，纤维蛋白原由3种线状的糖蛋白分子所构成，蛋白质长链通过二硫键结合在一起形成分子量为34万的纤维蛋白原大分子，以溶解状态参与血液循环，通过血液凝固反应，在凝血酶的作用下纤维蛋白原能被转变成不溶的纤维蛋白（血栓）沉积在血管壁上。纤溶系统的纤溶酶原和纤溶酶原激活剂通过赖氨酸结合位点与纤维蛋白相结合，在该结合部位形成的纤溶酶将纤维蛋白分解，纤溶酶原被两种纤溶酶原激活剂（plasminogen activator,PA)尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminoge

5、n activator,uPA)和组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)激活成具有活性的纤溶酶，该纤溶体系的活性以及纤溶酶原转换成纤溶酶的变化过程被PA抑制剂PAL-1（plasminogen activator inhibitor 1)、2-抗纤溶酶（2-antiplasmin)所调节。     在血液凝固-纤溶体系，一些生理活性成分能够通过（1）促进非活化状态的纤溶酶原向活化的纤溶酶的转化；（2）提高纤溶酶原的血栓结合活性；（3）改变纤溶酶原的空间结构使该酶原处于容易被纤溶酶原激活剂活化的状态；（4）

6、促进血液中微量存在的尿激酶型纤溶酶原激活剂前体（prourokinase)向尿激酶型纤溶酶原激活剂的转化从而开始纤溶作用的爆发式血栓溶解反应，来加快纤溶酶原向纤溶酶的转化或促进纤溶酶的纤维蛋白（血栓）酶解反应过程，血管中因病理作用生成的血栓将被溶解并进而消除血    栓症。从天然化合物中探索针对于纤溶体系的酶原、酶的 特异性生理活性物质作为血栓症的治疗药物将不存在生理性的出血危险性，并且会适用于慢性及早期血栓症状。基 于上述事实和理论基础，利用纤溶体系的酶原3，18（plasminogen,prourokinase)、血栓构筑的in vitro检索体系从微生物和海

7、藻的代谢产物中已经发现了纤溶酶原的活性促进物质如complestatin,staplabin,plactins,surfactin和尿激酶型纤溶酶原激活剂前体的内因性活性促进物质glucosyldiacylglycerol等，这些化合物的促进纤溶作用或者是刚被发现、或者是活性低等原因，离临床应用还需要作大量的研究。但由于低分子化合物在微血栓、慢性血栓和使用上的巨大潜力和安全性，在溶血栓药物的研究领域，发现和研究低分子纤溶促进化合物正在成为探索新型纤溶疗法药物的重要途径。一些研究者在探索促进纤溶作用的低分子天然化合物时，发现了一些具有促进纤溶作用的化合物，本文归纳了这些化合物的探索途径、分离纯化

8、、特性和促进纤溶作用的机制。     1  纤溶酶原的空间结构和活化     在血液中循环的纤溶酶原（Glu1-plasminogen;Glu-Plg)具有闭合的空间结构，在血液中被纤溶酶原激活剂低效率的活化4，5，这种闭合型的空间结构被存在于N末端80个残基（N-terminal peptide,NTP)中的赖氨酸残基（Lys50或Lys60）与存在于第5个链回环（K5）上的氨基已糖结合位点形成分子内结合键所维持5，6，当第5个链回环上的氨基已糖结合位点与纤维蛋白（或细胞受体）相结合时，NTP-K5的相互作用被解除，纤溶酶

9、原分子被转变成开放型的结构，纤溶酶原分子在空间驰豫，从而裸露在纤维蛋白（血栓）表面的赖氨酶残基与纤溶酶原上显露出来的赖氨酸结合位点结合后，在空间驰豫的纤溶酶原被结合到纤维蛋白表面，纤溶酶原进一步被存在于其附近的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA)高效率的转变成纤溶酶。由于纤溶酶原其分子结构上的闭合状态与开放状态的转化特性（图1），在纤维蛋白（或是细胞间质）上，纤溶酶原的活性表现出是局域性的，血栓（纤维蛋白）溶解最先开始于赖氨酸残基的周围，其作用机理如图2所示。另外，随着纤溶的进行，Glu-Plg的N末端短肽被丝氨酸蛋白酶纤溶酶所切断，Lys78-plasminogen (Lys-Plg)在纤溶酶所

10、出现的区域产生，Lys-Plg分子由于不带有NTP-K5分子内结合键，所以是开放型构造，容易活化，并且通过高亲和性与纤维蛋白结合。低分子化合物-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)或氨甲环酸(tranexamin acid)结合在K5链回环的赖氨酸结合位点，使Glu-Plg成开放性构型，因此，赖氨酸类似物显著地促进Glu-Plg的活性化，但与此相对，赖氨酸类似物阻碍了纤溶反应（纤维蛋白的分解），这是由于介于纤溶酶原链回环上的赖氨酸结合位点的Glu-Plg-纤维蛋白复合物的形成被阻抑了。在纤维蛋白溶解反应的局域性和纤溶反应的高效性上，血液中的Glu-Plg与纤维蛋白的

11、结合以及由此带来的空间结构的变化发挥着重要的作用。纤溶酶原是由791个氨基酸构成的单链糖蛋白，构成糖约占分子量的2%。从N末端开始顺次分为N末端短肽结构域（N-terminal peptide,NTP)、5个链回环结构域（kringle 1,kringle 2,kringle 3,kringle 4,kringle 5)、酶活性中心结构域和C末端氨基酸。酶活性中心在His603-Asp645-Ser740,uPA或tPA限定分解Arg561-Val562肽键（图中的虚心箭头位置）成双链的纤溶酶，PA（plasminogen activator)切断Arg561-Val562肽键后，N端的A链（

12、或重链）C端的B链（或轻链）。     图中圆圈和其中的字母表示具体的氨基酸及其位置：数字表示从N末端起始的氨基酸序列：实心箭头表示弹性蛋白酶（elastase）、胃蛋白酶（pepsin)、鲜黄蛋白酶V8(aureus V8 protease)的水解位点，共6个；虚心箭头表示纤溶酶原激活剂的作用位点；短横线表示分子内二硫键，共23个；短折线表示糖链；实心圆圈和其中的字母表示活性中心氨基酸及其位置。     Glu-Plg由NTP、5个链回环结构域（K1K5）、丝氨酸蛋白酶活性中心结构域构成，在K1、K2、K4、K5存在赖氨酸结合位点，

13、K5的赖氨酸结合位点由于也能识别氨基已糖，所以又称作氨基已糖结合位点，能结合肽链中的赖氨酸。Glu-Plg分子的NTP Lys50(或Lys62)在K5的AH位点上形成分子内结合链，维持着紧密的空间结构，对活化作用显示出抵抗性。通过K5与纤维蛋白或细胞受体的结合，以及纤溶酶切断NTP，都会使纤溶酶原的空间结构发生驰豫，从而感受到PA的活性化。     2  促进纤溶作用的化合物     到目前为止，主要的纤溶促进化合物（图3）的特性被归纳在表1，这些化合物的探索途径、分离纯化和纤溶促进机制分述如下。  &

14、#160;   图3  促进纤溶作用的低分子天然化合物 表1  具有纤溶促进作用化合物的特性注：-没有实验数据；*含有不同于纤溶酶原作用特点的特征     2.1  complestatin和chloropeptin 1  以纤溶酶原和纤溶酶原受体构成in vitro检索体系，用于探索促进纤溶酶原向受体结合的低分子天然化合物。认为促进纤溶酶原向纤溶酶原受体结合的化合物也会促进纤溶酶原和纤维蛋白（血栓）的结合，进而促进血栓的溶解。以U937细胞作为纤溶酶原受体的供体，使用人纤溶酶原构成了纤溶促进化合物的检索

15、体系，在对约5000株微生物的代谢产物进行筛选的基础上，从链霉菌属（Streptomyces)的一株代谢产物中发现了低分子化合物图3）complestatin和chloropeptin 17,8促进了纤溶酶原向U937纤溶酶原受体的结合。该化合物是从土壤的分离菌株中分离纯化的，将活化培养的种子液接种到由可溶性淀粉3%、肉膏1%、混合溶液1.5%、玉米浸出汁2%和消泡剂CB442 0.01%构成的液体培养基（pH7.0）中，在25、310 rpm的条件下连续培养3天，收获的菌丝用70%丙酮溶液提取，提取物用乙酸乙酯萃取，萃取物经丙酮-甲醇（5：1）硅胶层析后，活性化合物被移动相为含0.2%三氟醋

16、酸的45%乙氰水溶液的高压液相色谱柱（Inertsil PREP-ODS)所精制。     chloropeptin 1是complestatin (c61H45N7O15Cl6,MW1325)的异构体，只在苯甘氨酸-色氨酸残基的结合位置不同。complestatin和chloropeptin 1在0.510M的添加浓度下，使Glu-Plg向U937细胞的结合增加了25倍，这些化合物由于也增加了Glu-Plg和纤维蛋白的结合，所以可以认为这些化合物是作用于纤溶酶原的，另外，这些化合物的作用能被-氨基已酸所阻碍，并且从化合物的作用特点能认为纤溶酶原和U937细胞没有

17、形成新的结合方式，是complestatin和chloropeptin 1促进了纤溶酶原和U937细胞介于赖氨酸结合位点结合的增加。伴随着纤溶酶原向细胞或纤维蛋白结合的增加，细胞或纤维蛋白上纤溶酶的生成也增加了。在使用全血形成血栓的纤溶实验上，确认了两种化合物介于tPA促进了血栓的溶解8，这之后，又确认了这些化合物带来了Glu-Plg空间结构的变化以及促进了介于uPA的Glu-Plg的活性化，从Glu-Plg空间结构的变化也能说明Glu-Plg向U937细胞结合的增加。另外，这些化合物不能直接促进纤溶酶以及纤溶酶原激活剂的酰胺分解活性。     2.2 

18、 萜类化合物（staplabin,SMTPs: Stachybotrys Microspora Triprenyl Phenol)  在探索Glu-Plg和纤维蛋白结合的促进化合物上，利用纤溶酶原-尿激酶前体-S2251的in vitro筛选体系，从微生物的培养液发现了新型的萜类代谢产物9，这之后，又发现了8种新型同类化合物1012。Staplabin（图3）具有显著的促进纤溶作用，该化合物分离于土壤微生物Stachybotrys Microspora的一个菌株。将经过种子培养的菌株接种到1L培养液含30g葡萄糖、10g脱脂豆粉、3g肉膏、3g酵母粉、3g蛋白粉、0.5g磷酸二氢钾、

19、0.5g七水硫酸镁和0.1g消泡剂CB442的培养基中，在25、180rpm用500ml三角瓶连续培养35天，培养液离心后，上清液用等量的2-丁酸抽提，抽提物用二氯甲烷和甲醇展开于硅胶层析柱，活性成分被Inertsil SIL-ODS精制，移动相是流速为9.9ml/min的乙烷和乙醇（98：2）的混合溶液。     300500M的staplabin使Glu-Plg和Lys-Plg与纤维蛋白的结合增加了，这种增加依赖于Glu-Plg和Lys-Plg上的赖氨酸结合位点，并且在纤溶酶原激活剂存在下，Glu-Plg和Lys-Plg的活化被促进了，所以体现出提高了纤溶酶的分解活性13，在使用分子排除层析的实验上由于该化合物部分地缩短了Glu-Plg和Lys-Plg的溶出时间，所以被认为该化合物使这些分子驰豫。纤溶酶原活性化的促进作用在-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)和纤溶酶原断片存在的情况下也能观察到，所以能认为staplabin带来的构型的变化和complestatin这些化合物带来的变化是不同的13，这种结果，也被staplabin的活性化促进作用能在mini-Plg上观察到的事实所支持。SMTPs Stac