抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用

1、抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用         11-01-31 09:29:00     编辑：studa20                  作者：唐文心, 王建和, 陈正望, 陈孝平【摘要】  目的: 制备抗硫氧还蛋白1（TRX1）的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法

2、: 以原核表达的TRX1为抗原免疫BALB/c小鼠, 按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株, 用ELISA 检测mAb腹水的效价、 相对亲和力和进行表位分析, 用Western blot法对mAb的特异性进行鉴定。结果: 得到筛选出3株能稳定分泌抗TRX1的杂交瘤细胞株B6、 D5和E3, 免疫球蛋白亚类均为IgG1 (), 腹水mAb效价均在106以上, 3株抗体分别针对不同抗原表位。用mAb建立的竞争抑制ELISA灵敏度达1.22 g/L。结论: 获得3株特异性好、 亲和力高、 能稳定分泌抗TRX1的杂交瘤细胞株, 为研究TRX1在人类细胞、

3、血液、 组织中的表达及定位提供了可能, 并为探索相关炎症、 癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具。 【关键词】  人硫氧还蛋白 1 单克隆抗体 竞争抑制ELISA硫氧还蛋白1（thioredoxin1,  TRX1）相对分子质量（Mr）约为12 000,  属于进化保守的氧化还原蛋白家族,  具有活性中心(TrpCysGlyProCysLys),  它与TRX1还原酶和 NADPH共同构成调节细胞氧化还原状态的巯基氧化还原系统（TRX系统）。1964年TRX1在大肠杆菌中首次被发现至今1,  被证实广泛存在于原核、 真核生物中,

4、  具有多种重要功能,  如抑制细胞凋亡、 增加转录因子活性,  刺激细胞增殖及血管生成,  作为DNA合成的辅助因子2。临床研究发现,  在氧化应激及炎症状态下包括HIV感染、 类风湿性关节炎、 Sjogrens综合症、 急性冠状动脉综合征和扩张性心肌病等,  患者血清中TRX1水平将大大提高。更有趣的是,  许多人类恶性肿瘤中均发现TRX1的过表达,  包括肺癌、 直肠癌、 肝癌、 胰腺癌、 胃癌、 乳腺癌、 淋巴癌等3,  故将TRX1作为一项病理指标并提示可将TRX1及TRX1系统作为癌症治疗的新

5、靶点,  具有潜在的应用价值。1  材料和方法1.1  材料  表达载体pET32a,  pcDNA3.1(+)大肠杆菌 DH5和BL21,  人乳腺癌细胞MCF7细胞株由本实验室保存。 MMLV反转录酶,  DNA限制性内切酶,  T4 DNA ligase,  Klenow酶,  pfu聚合酶和 dNTP购自TaKaRa公司。IPTG酵母提取物及胰蛋白胨为 OXOID公司产品。肌动蛋白（actin）及其单克隆抗体（mAb）、 微管蛋白（tublin）及其mAb、 牛血清白蛋白（BSA）、 B

6、CA试剂盒及DMEM培养基均为Sigma公司产品。弗氏佐剂为Gibco BRL公司产品。46周龄雌性BALB/c小鼠（体质量1822 g）购自湖北省实验动物研究中心。Sp2/0细胞由中国农业大学传染病与微生物学教研室提供。酶联免疫检测仪为Labsystems dragon公司产品。Sephadex G25凝胶柱为Phamarcia产品。IgG 亚类（型）ELISA检测试剂盒为Pierce公司产品。其他试剂均为国产分析纯。1.2  方法1.2.1  TRX1的原核表达及纯化  由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物对:  P1 5CGGAATTCAAT

7、GAACGGCCCTGAAGATCT3;  P2 5CGGAATTCTCAGCAGCCAGCCTGGAGGA3。提取人乳腺癌细胞MCF7总 RNA,  用MMLV反转录成cDNA,  以此cDNA为模板,  P1和P2作为引物,  用高保真DNA聚合酶pfu进行扩增,  反应程序为: 94 30 s,  55 60 s,  72 40 s,  循环30次。其产物和pcDNA3.1(+)载体连接得到pcDNATRX1。使用Kpn I和Xho I将从pcDNATRX1上将TRX1基因切下后克隆到pET32a的

8、相同位点中,  得到原核表达载体pET32aTRX1。提取pET32aTRX1质粒转化大肠埃希菌 BL21工程菌,  以单菌落接种于 LB培养基（含氨比西林50 mg/L）中振荡培养过夜,  1%转接后继续振荡培养至A值为0.5,  加0.4 mmol/L IPTG诱导表达。将 BL21重悬于预冷的Tris缓冲液（pH7.9,  含5 mmol/L咪唑,  0.5 mol/L NaCl和20 mmol/L TrisHCl）中,  加入10 g/L Triton X100后超声破碎,  12 000 

9、60;  g,  10 min离心后取上清。将超声后的上清以15 mL/h的速度过Ni亲和柱,  再用20倍柱床体积的PBS（含0.5 mL/L Tween20）洗柱3次,  以洗脱杂蛋白,  再加入100 g/unit thrombin蛋白酶于22轻柔振荡16 h,  用8 mL的PBS洗脱,  收集洗脱液。再用100 mmol/L咪唑洗脱标签蛋白。1.2.2  免疫原BSATRX1的制备  参考文献 4,   将10 mg BSA溶于0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(CB, 

10、; pH9.0,  含9 g/L NaCl和1 g/L SDS)中,  加入2.5 g/L戊二醛水溶液20 L,  避光反应1 h。反应液流经Sephadex G25凝胶柱以除去未反应的戊二醛,  0.1 mol/L pH9.0 的CB洗脱,  收集蛋白洗脱峰。在洗脱液中加入2 mg TRX1,  避光反应16 h后,  加入终浓度为1 mol/L的甘氨酸终止反应6 h。将反应液放入截流Mr为3 000的透析袋中,  于 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）中透析24 h,  每34 h换液1次,&

11、#160; 最后用BCA法测定蛋白浓度,   冻干,   -20保存。1.2.3  杂交瘤细胞建立和腹水制备及抗体纯化  将BSATRX1加弗氏完全佐剂乳化后,  经背部皮下多点注射BALB/c小鼠,  100 g/只。免疫后第28、 40及第52天,  将BSATRX1与弗氏不完全佐剂乳化后,  以上述途径各加强免疫1次,  50 g/只。于融合前34 d,  再以50 g/只的BSATRX1不加佐剂经腹腔注射加强免疫1次。细胞融合、 筛选、 克隆化、 腹水制备及抗体纯化均

12、按常规方法进行,  其中抗体的纯化使用辛酸硫酸铵沉淀法5。1.2.4  mAb的特性鉴定  (1)mAb的Ig亚类（型）:  采用ELISA检测试剂盒进行鉴定。(2)腹水mAb的效价: 采用间接ELISA检测。37孵育后,  用10 g/L的明胶封闭,  将腹水做1102 1108稀释后,  加入到4 mg/L TRX1包被的酶标板中,  反应1 h后,  洗涤,  加入辣根过氧化物酶标记（HRP）的羊抗小鼠IgG抗体, 加底物显色后,  测定各孔的A492值。(3)mAb亲和力测定:

13、 分别用1.0 mg/L、 2.0 mg/L、 5 mg/L的TRX1包被酶标板,  间接ELISA法测定各孔的A492值。然后以细胞上清中mAb的浓度为横坐标,  以其相应的A值为纵坐标,  绘制3条测定曲线,  以各曲线上部趋于平坦的A值为100%,  计算A值为50%时的mAb的浓度Abt,  这样每份被检样品可得Abt1、Abt2、 Abt3三个值,  然后根据文献5公式计算出其亲和常数。(4)mAb在Western blot中的应用: 检测TRX1标准品,  BSA为阴性对照,  其中一抗工作浓

14、度为110 000; 羊抗鼠IgG（二抗）工作浓度为15 000。(5)mAb的表位分析: 采用间接ELISA相加实验。根据腹水mAb的效价,  将3株腹水分别稀释至饱混和时的工作浓度,  在此浓度下各取50两两混匀。分别测定混和的mAb及饱和浓度下3株腹水mAb的A492值。计算加成指数AI=2A1+2/(A1+A2)-1×100%。式中A1、 A2分别为2株不同mAb所测的A492值,  A1+2为两两混和抗体所测的A492值。每组重复实验3次,  计算其平均值,  AI值大于50即认为两种mAb识别不同的抗原表位。1.2.5&#

15、160; 竞争性抑制ELISA的建立  参照文献5,  6的方法,  在按常规ELISA 方法包被和封闭酶标板后,  将TRX1、 BSA和戊二醛标准品以20 mg/L 溶于抗体稀释液中,  并进行倍比稀释7,  共15个稀释梯度,  第16孔以抗体稀释液作为阴性对照,  各取50 L,  另将纯化的mAb D5（0.33 mg/L）50 L与标准抗原、 抗体稀释液充分混合后,  室温反应30 min,  加入到酶标板中,  100 L/孔,  37孵育1 h; 洗

16、涤,  加入适宜浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体,  100 L/孔; 洗涤,  加入底物邻苯二胺(OPD)溶液,  100 L/孔,  37闭光显色20 min。用50 L/孔2 mg/L H2SO4终止反应后,  测定各孔的A492值。    另外在按普通ELISA 方法包被和封闭酶标板后,  将TRX1标准品从10 mg/L作倍比稀释,  共16 个稀释梯度,  同时将1 g/L纯化的mAb D5作15 000 稀释。将二者等体积充分混合后,  室温反应15

17、 min,  加入到酶标板中。然后再加入酶标二抗37 1 h,  加入底物显色。检测结果用Microcal Origin 6.0软件进行分析。    以各质量浓度TRX1 (包括0 g/L)的A492值转换成B/B0,  其中无TRX1抑制时的A492值为B0,   各相应质量浓度的TRX1抑制时的A492值为B,  因为B/B0值与lgTRX1成线性回归关系,  从而可计算回归曲线的方程与相关系数。1.2.6  检测不同刺激下MCF7细胞中TRX1的变化  6孔板中MCF7

18、乳腺癌细胞培养至密度约为70后,  先对4孔细胞做四种不同处理,  分别为向DMEM培养基中加入100 mol/L 过氧化氢（H2O2）,  10  mol/L 三氧化二砷（As2O3）,   200     mol/L 过硫酸铵（APS）和40下孵育30 min,  再将细胞正常孵育24 h,  提取细胞总蛋白8,   用Western blot检测TRX1含量。其中一抗工作浓度为110 000; 羊抗鼠IgG（二抗）工作浓度为15 000。2  结果2.1  TRX1的制备和纯化  含重组质粒的工程菌经IPTG诱导,  获得了重组蛋白的高效表达,  SDSPAGE分析中重组蛋白出现在Mr 14 000的位置,  与目的蛋白的