11细胞核与染色体

1、第十一章.细胞核与染色体细胞核(nucleus)是细胞内储存遗传物质的场所。真核生物的细胞都有细胞核, 只有成熟的红细胞和植物成熟的筛管没有细胞核。细胞核主要有两个功能: 一是通过遗传物质的复制和细胞分裂保持细胞世代间的连续性(遗传); 二是通过基因的选择性表达, 控制细胞的活动。典型的真核生物细胞核的结构由五个主要组成部分（图11-1）核被膜、核质(nucleoplasm)、核仁、核基质(nuclear matrix)、DNA纤维。图11-1 间期的细胞核的形态结构在细胞水平上原核细胞与真核细胞的主要差异是什么?( 在细胞水平上原核细胞与真核细胞的主要差异是什么?（答案） 答: 原核生物没有

2、真正的细胞核,而只有拟核(nucleiod)。在细胞水平上原核和真核有三方面主要差别: 核膜: 真核细胞有核膜, 原核细胞没有核膜, 称之为拟核; 核仁: 真核细胞有核仁, 原核细胞无核仁;核内遗传物质的存在状态: 真核细胞内DNA同组蛋白结合, 有染色体结构；原核近年也发现同蛋白质结合, 但无染色体结构。) 11.1 核被膜(nuclear envelope)真核生物的细胞核是在细胞周期的间期才能见到的细胞内的结构，此时的染色质被两层单位膜包裹，因此核被膜是细胞核最外层的两层膜结构，它的形成对于细胞的生命活动具有重要意义。 11.1.1 核被膜的结构核被膜的结构比较复杂,

3、 它由外核膜、内核膜、核周腔、核孔复合物和核纤层等5个部分组成(图11-2)图11-2 核被膜的结构外核膜(outer nuclear membrane) 外核膜面向细胞质基质, 常附有核糖体, 有些部位与内质网相连, 外核膜可以看成是内质网膜的一个特化区。内核膜(inner nuclear membrane) 内核膜面向核基质，与外核膜平行排列, 其表面没有核糖体颗粒。核纤层(lamina) 在与核质相邻的核膜内表面有一层厚30160nm 网络状蛋白质, 叫核纤层, 对核被膜起支撑作用。核纤层由3种相对分子质量为67万道尔顿的多肽亚单位、所组成, 属于中间纤维的一种, 其中亚基与内核膜的特异

4、受体蛋白相结合, 、亚单位与相连接, 而、又同染色质的特定部分相结合。核周腔(perinuclear space) , 是两层核膜之间的空隙, 宽1530nm, 其中充满无定形物质。由于外核膜与粗面内质网相连, 所以核周腔常与ER的腔相通。11.1.2 核孔复合物(nuclear pore complexs,NPCs)核被膜上有许多孔, 称为核孔( nuclear pore ),是细胞核膜上沟通核质与胞质的开口, 由内外两层膜的局部融合所形成, 核孔的直径为80120nm(图11-3)。图11-3 高分辩率扫描电镜观察的核孔复合物照片(a). 两栖类卵细胞分离的NPC的细胞质面, 细胞质颗粒覆

5、盖在NPC的胞质环上; (b). 当观察NPC核质面时, 可以看到与核孔复合物相连的篮(basket)。NPC是一轮形结构, 外经120 nm, 并呈现8面对称。轮毂是一个圆柱形的活塞(plug), 称之为中央运输蛋白(central transporter)。从中央运输蛋白向外伸出8个辐条(spoke)并与核孔复合物的细胞核面的核质环(nucleoplamic ring)和细胞质面的胞质环(cytoplasmic ring)相连。在胞质环的表面常有8个细胞质颗粒位于其上, 而核质环上有细纤丝伸向核质, 形成笼形结构, 称之为篮。在某些生物中,NPC篮常同一种交织的纤维层相连, 称之为核被网格

6、(nuclear envelope lattice)。后来发现在胞质环上也有细胞质纤维伸向细胞质。由于这种结构象鱼笼, 所以有人称之为鱼笼模型(图11-4)。图11-4 核孔复合物的结构模型该三维模型显示了核孔复合物与核被膜的内、外核膜的关系。中央运输蛋白伸出的8个辐条与胞质环和核质环相连, 另有8个篮和8个细胞质颗粒在核孔复合物中呈现8重对称分布。11.1.3 核被膜的功能核被膜是真核生物和原核生物之间的重要区别，具有十分重要的功能。核被膜的形成对细胞的生命活动具有什么意义?( 核被膜的形成对细胞的生命活动具有什么意义?（答案） 答: 主要有以下三方面的意义:基因表达的时空隔离在原核生物中,

7、 基因表达是连续进行的, 即mRNA的转录和蛋白质的合成相偶联。这主要是因为原核细胞结构简单, 原核生物的基因转录物无须经过剪接。真核生物的结构复杂, 而且大多数基因都有内含子, 转录后需要经过复杂的加工, 所以核膜的出现, 为基因的表达提供了时空隔离的屏障, 便于DNA在核内活动的多样性。核膜作为保护性屏障, 使核处于一微环境中细胞核是在进化过程中形成的。在细胞的遗传信息储存量越来越丰富以及由遗传信息所指导的代谢规模越来越大的情况下，有必要将携带遗传信息的染色质与细胞的其它部分隔离开来。核膜的出现，为细胞遗传信息的保存、复制、传递及发挥其对细胞代谢和发育的指导作用创造了特定的微环境，提高了上

8、述各项活动的效率；避免直接受细胞内其它各种生命活动的干扰，并防止细胞中这个调度中枢的功能轻易地随环境条件的变化而变化，以保持其相对的稳定性，这些都是核膜出现的进化意义。染色体的定位和酶分子的支架染色质通过核纤层同核膜相连, 使之多而不乱, 保证了有序性。另外, 核内的一些酶是以膜蛋白的形式存在的, 这就有利于核内生化反应的区域化, 从而发挥高度的催化活性。所以核膜是染色体和酶分子的支架和固着部位。)  基因表达的时空隔离真核生物的结构复杂, 而且大多数基因都有内含子, 转录后需要经过复杂的加工, 所以核膜的出现, 为基因的表达提供了时空隔离的屏障, 便于DNA在核内活动的多样性, D

9、NA转录形成RNA的多样性, 从而导致细胞的多样性。  核膜作为保护性屏障, 使核处于一微环境中核膜的出现，为细胞遗传信息的保存、复制、传递及发挥其对细胞代谢和发育的指导作用创造了特定的微环境，提高了上述各项活动的效率；避免直接受细胞内其它各种生命活动的干扰，并防止细胞中这个调度中枢的功能轻易地随环境条件的变化而变化，以保持其相对的稳定性，这些都是核膜出现的进化意义。  染色体的定位和酶分子的支架另外, 核内的一些酶是以膜蛋白的形式存在的, 这就有利于核内生化反应的区域化, 从而发挥高度的催化活性。所以核膜是染色体和酶分子的支架和固着部位。11.2 核孔复合物的运输作用核孔

10、复合物的主要功能就是进行物质运输。1965年，Ccarl Feldherr通过什么实验证明了核孔的运输作用？(1965年，Ccarl Feldherr通过什么实验证明了核孔的运输作用?（答案） 答: 1965年，Ccarl Feldherr 将各种不同大小的金颗粒注射到变形虫的细胞质中，然后检查这些颗粒进入细胞核的情况，发现小的金颗粒很快进入了细胞核，但体积越大进入的速度就越慢，大于10nm的金颗粒就进不了细胞核，由此推测核孔可作为水性的运输通道，允许小分子的物质自由扩散出入细胞核(图E11-1)。图E11-1 核孔的运输作用) 11.2.1核孔运输作用的一般特点核孔复合物作为运输通

11、道既有被动运输,又有主动运输。被动运输是通过简单扩散, 主动运输是一个信号识别与载体介导的过程, 需要ATP, 并表现出饱和动力学特征。核孔复合物进行的运输不仅具有选择性,而且具有双向性, 不仅能够将翻译所需要的RNA、组装好的核糖体亚基从细胞核内运送到细胞质, 同时也能把DNA复制和转录所需的酶以及帮助DNA装配的一些蛋白质从细胞质运进细胞核, 这些蛋白均是在细胞质的游离核糖体上合成的, 核内物质的输出和输入都是信号介导的过程。11.2.2 核孔运输的信号指导在生理状态下, RNA的输出可能是一种具有高度选择性的信号指导的过程。在RNA聚合酶指导下合成的RNA(mRNA和snRNA), 当其

12、5'端具有m7 GpppG帽子结构时, 即被定位于细胞质, 而没有帽子结构的snRNA则定位在细胞核。如何证明m7GpppG帽子结构具有核输出的信号作用？(在生理状态下, 细胞核RNA的输出可能是一种具有高度选择性的信号指导的过程。在RNA聚合酶指导下合成的RNA(mRNA和snRNA), 当其5'端具有m7 GpppG帽子结构时, 即被定位于细胞质, 而没有帽子结构的snRNA则定位在细胞核。如何证明m7 GpppG帽子结构具有核输出的信号作用?（答案） 答: 将游离的具有帽子结构的类似物m3 GpppG二核苷酸向核内进行连续注射, 发现可抑制新转录的具有m7 G帽子的U1s

13、nRNA的核输出；而注入m7 GpppG却没有这种效应, 说明5'端m7 G帽子结构对于mRNA及U1snRNA的核输出是关键信号。这种现象称作帽结合活性(cap binding activity, CBA)。在细胞核中由RNA聚合酶合成的U1，U2，U4和U5 snRNA在合成之后立即在5' 端加上m7G的帽子结构，然后这些加工过的snRNA被运输到细胞质中同相应的蛋白质组装成snRNPs,再运回到细胞核参与RNA的剪接。在细胞核中snRNA须进一步甲基化成m2,2,7G。但是，由RNA聚合酶合成的U6snRNA的5端没有m7G的帽子结构，只有一个三磷酸核苷，所以它不会被运送

14、到细胞质中。后来有人将RNA聚合酶的启动子同U1snRNA连接起来，转录成的U1 snRNA也不能被运送到细胞质(图E11-2)。图E11-2 U1snRNA从细胞核向细胞质运输需要5帽子结构的试验证明 )11.2.3 核蛋白、核定位信号、输入蛋白、输出蛋白 核蛋白(nuclear protein)核蛋白是指在细胞质中合成, 然后运输到核内起作用的一类蛋白质。  核定位信号(nuclear localization signal, NLS)核定位信号是另一种形式的信号肽, 这种信号肽序列可以位于多肽序列的任何部分。一般含有 48个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核

15、。 入核信号与导肽的区别在于: 由含水的核孔通道来鉴别; 入核信号是蛋白质的永久性部分,在引导入核过程中,并不被切除, 可以反复使用, 有利于细胞分裂后核蛋白重新入核。 有多种类型的核定位信号(表11-1)，这些信号都具有一个带正电荷的肽核心。 第一个被确定的NLS序列的蛋白质是SV40的T抗原(MW=92kDa), 它在细胞质中合成后很快积累在细胞核中, 是病毒DNA在核内复制所必需的蛋白质。其野生型的氨基酸序列为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, 即使单个氨基酸突变所产生的突变型NLS(Pro-Lys-Tyr-Lys-Arg-Lys-Val)也能阻止这种蛋白质进入细胞

16、核而停留在细胞质中。如果将这种信号接到非核蛋白的随机Lys的侧链上, 则非核蛋白也能转变成核蛋白。表11-1 几种核定位信号的结构（黑体表示入核必需的残基）信号类别蛋白名称信号在蛋白中的位置信号序列单信号SV40病毒大T抗原残基126-132Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val腺病毒E1aC-末端Lys Arg Pro Arg Pro流感病毒核蛋白靠近C-末端336-345Ala Ala Phe Gly Asp Leu Arg Val Leu Ser二重信号非洲爪蟾核质蛋白靠近C-末端155-171Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Gly Gln

17、 Ala Lys Lys Lys Lys Leu非洲爪蟾N1核蛋白内部534-550Lys Arg Lys Thr Glu Glu Glu Ser Pro Leu Lys Asp Lys Asp Ala Lys Lys酵母SW1 5转录因子内部636-652Lys Lys Tyr Glu Asn Val Val Ile Lys Arg Ser Pro Arg Lys Arg Gly Arg鼠poly-ADP核糖体聚合酶内部208-224Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Thr Asp Glu Val Val Lys Lys Lys Glu鸡雌激素受体内部205-2

18、60Arg Lys Asp Arg Arg Gly Gly Glu Met Met Lys Gln Lys Arg Gln Arg Glu  核输出信号(nuclear expotr-signal,NES), 作为核内物质输出细胞核的信号，帮助核内的某些分子迅速通过核孔进入细胞质。另外, 有些蛋白并非是核内常驻"人口", 通常要往返于核质和胞质之间, 这些穿梭蛋白既有NLS又有NES。  输入蛋白(importin) 仅有核定位信号的蛋白质自身不能通过核孔复合物, 它必须在水溶性的NLS受体的帮助下才可进入核孔复合物, 这种受体称为输入蛋白, 分布在胞质

19、溶胶。它们作为一种穿梭受体(shuttling receptor)在细胞质内与核蛋白的核定位信号结合, 然后一起穿过核, 在核内与亲核蛋白分离后再返回到细胞质中。  输出蛋白(exportin)存在于细胞核中识别并与输出信号结合的蛋白质, 帮助核内物质通过核孔复合物输出到细胞质, 而后快速通过核孔回到细胞核中。11.2.4 核运输系统(nuclear-transport system)由于核孔复合物的运输是双向的,所以核运输系统包括核蛋白的输入和核物质的输出。  核质蛋白(nucleoplasmin)的输入作用核定位信号与核蛋白的输入最早是通过核质蛋白(nucleoplas

20、min)的注射实验发现的。这一实验是如何进行的? 结论是什么? (核定位信号与核蛋白的输入最早是通过核质蛋白(nucleoplasmin)的注射实验发现的。这一实验是如何进行的? 结论是什么? （答案） 播放动画 答: 核质蛋白是一种丰富的亲核蛋白, 具有头尾两个不同的结构域，由5个单体组成, 相对分子质量为165kDa, 是耐热性可溶蛋白。首先对核质蛋白进行标记, 然后用蛋白酶对核质蛋白进行有限的消化, 分离纯化头部和尾部。将具有标记的完整的核质蛋白、头部、尾部以及用 胶体金包裹的尾部分别注射到非洲爪蟾的卵母细胞质中。温育后分离细胞核和细胞质进行放射性检测分析。结果表明:完整的单独的未被包裹

21、的尾部能够进行细胞核, 其它则不能。这一实验结果说明尾部具有核定位信号, 并且只要有一个尾部结构, 就可将全部的头部带入细胞核(图E11-3)。图E11-3 核质蛋白输入细胞核的实验)根据对核蛋白运输机制的研究和相关蛋白的发现, 提出了核蛋白的运输模型(图11-5)。图11-5 含有NLS信号的核蛋白从细胞质输入细胞核的推测模型 请对这一模型作出文字说明(RCC1:Ran nucleotide-exchange factor1)。(根据对核蛋白运输机制的研究及相关蛋白的发现, 提出了核蛋白的运输模型(图Q11-1), 请对这一模型作出文字说明(PCC1:Ran nucleotide-excha

22、nge factor1)。（答案） 图Q11-1 含有NLS信号的核蛋白从细胞质输入细胞核的推测模型答: 按照这一推测的模型，在细胞质中的核运输蛋白、核运输蛋白和货物蛋白（cargo protein）相互作用形成一个运输复合物，其中运输蛋白亚基识别并与NLS结合。而运输蛋白亚基与核孔复合物作用，将复合物转运到细胞核中。在此过程中需要消耗ATP。在细胞核中，Ran·GTP（一种小GTP结合蛋白）与输入蛋白亚基相互作用，导致货物蛋白与复合物脱离，成为细胞核中的游离蛋白。为了进行下一个运输循环，输入蛋白亚基和输入蛋白亚基-Ran·GTP复合物重新回到细胞质。细胞质中的Ran

23、83;GTP-激活蛋白（RanGAP）将Ran·GTP转变成Ran·GDP, 并使Ran·GDP与输入蛋白亚基脱离，游离的输入蛋白亚基和亚基一起参与新的具有NLS信号的入核蛋白的运输。而Ran·GDP可通过核孔复合物回到细胞核中，在Ran核苷交换因子1(Ran nucleotide-exchange factor1,RCC1)的作用下，释放GDP, 重新结合GTP。)  核输出 细胞核内的物质输出到细胞质也是信号介导的过程。 细胞核内输出到细胞质的两类主要物质是各种RNA和核糖体亚基。输出的RNA中, mRNA是最多也是最重要的。细胞核中合成的

24、RNA很快与蛋白质形成hnRNPs(含有加工成熟的RNPs称之为mRNPs)后被运输到胞质溶胶。 昆虫chironomous tentans 幼虫的唾腺是研究hnRNPs的形成和mRNPs输出的很好模式系统。在这些幼虫中,大染色体胀泡(puff),又称巴尔比亚环(Balbiani rings,BR)中的基因大量转录成新的pre-mRNA, 并与hn-RNP蛋白形成直径为50nm的螺旋hn-RNPs(图11-6)图11-6 chironomous tentans Balbiani rings mRNA合成时螺旋状的hn-RNP的形成(a) 活跃转录的染色质环的电镜照片, 显示特征性颗粒(箭头所指

25、); (b) 单个转录环的形成, 其上结合许多RNP颗粒; (c)BRhnRNP的结构和生物发生模型。 通过电子显微镜研究揭示, Balbiani rings pre-mRNA加工之后形成的mRNAs通过核孔进入胞质溶胶, 形成非螺旋的mRNP,然后同核糖体结合, 据此推测, mRNP的5引导通过核孔复合物。 在上述研究的基础上提出了一个关于Balbiani rings mRNAs 通过核孔复合物运输的模型(图11-7)。后来的实验解释了关于大分子通过核孔复合物运输的详细细节, 发现了核输出蛋白。图11-7 根据电子显微镜研究提出的Balbiani rings mRNAs 输出核孔复合物的模型

26、螺旋化的mRNP 移向核孔复合物的末端环, 当它通过NPC的中央活塞时解螺旋。5端引导并与核糖体结合, 在运输过程中, NPC发生了构型的变化。 新的研究表明, 某些hn-RNP蛋白具有输出信号(NES), 促进通过核孔的主动运输。通过基因重组将核蛋白(如核质蛋白)的基因与hn-RNP基因重组, 获得穿梭蛋白。图11-8是含有丰富亮氨酸的NES穿梭蛋白的核输出模型。图11-8含有丰富亮氨酸核输出信号的货物蛋白的输出模型。请对这一模型进行文字说明(RCC1: Ran nucleotide-exchange factor1)。(某些hn-RNP蛋白具有输出信号(NES), 促进通过核孔的主动运输。

27、图Q11-2是含有丰富亮氨酸的NES穿梭蛋白的核输出模型。请对此模型进行文字说明(RCC1:Ran nucleotide-exchange factor1)（答案） 图Q11-2 含有丰富亮氨酸核输出信号的货物蛋白的输出模型答: 按照这一模型, NES通过与细胞核中特异的核输出受体,即核输出蛋白1的结合促进货物蛋白从细胞核向细胞质运输。核输出作用还需要第三种蛋白, Ran蛋白, 是一种小GTPase, 它与GTP或GDP结合时的构型是不同的。 输出蛋白1能够同时与Ran·GTP和货物蛋白的NES作用, 形成三分子的货物复合物。然后三体复合物通过至今尚不清楚的机制通过核孔。一旦Ran&

28、#183;GTP/输出蛋白1/货物蛋白复合物到达胞质溶胶, Ran GTPase激活蛋白(RanGAP)促进Ran水解与之结合的GTP,形成GDP, 致使Ran蛋白产生构型的变化, 使三体复合物解散,最后将货物蛋白释放出来。游离的输出蛋白1和Ran·GDP重新通过核孔回到细胞核, 在细胞核中Ran核苷交换因子(Ran nucleotide-exchange factor1,RCC1)使Ran释放GDP 结合上GTP, 开始下一轮的运输作用。) 至于mRNA的输出,有人提出类似的穿梭模型(图11-9)。图11-9 hn-RNP介导的mRNA输出细胞核的推测模型(a) 加工成熟的mRNA

29、-hnRNP的5端形成帽结合复合物(CBC), 该端首先通过NPC; (b)在通过核孔时, 核限制hnRNP蛋白与mRNP脱离; (c) 细胞质中RanGAP促使RanGTP水解, 穿梭的hnRNP回到细胞核, 释放出的mRNA同胞质溶胶中的mRNP蛋白, 包括poly(A)结合蛋白poly(A)-binding perotein,PABP结合。根据这一模型, 帽结合复合物(cap-binding complex, CBC)与5帽结构相关, 引导mRNP复合物通过核孔复合物。在此过程中推测有与输出蛋白1类似的受体蛋白的存在。11.3 分子伴侣(molecular chaperones)分子伴侣

30、是细胞中一大类蛋白质, 它们的作用广泛, 但都有一个基本的特性, 就是“乐于助人”。 11.3.1 分子伴侣的发现及种类 第一个被发现的分子伴侣:核质蛋白(nucleoplasmin)第一个被发现具有分子伴侣功能的蛋白是核质蛋白, 它在细胞核中通过降低组蛋白的正电荷, 帮助组蛋白和DNA形成正常的核小体, 其本身并不成为核小体的组成成分。  分子伴侣的概念及其特点 1978年Laskey等人在核小体装配实验中首次使用“伴侣蛋白”（chaperone)来描述核质蛋白在核小体组装过程的作用。 1991年Ellis等人提出了分子伴侣的基本概念：是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它

31、们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。 这个概念有三个特点:凡具有介导功能的蛋白, 都称为分子伴侣；作用机理不清楚；分子伴侣一定不是最终组装完成的结构的组成部分, 但不一定是一个分离的实体。  分子内伴侣(intramolecular chaperones)一些位于信号肽和成熟蛋白之间的前序列, 不仅抑制酶原蛋白的活性, 还作为分子伴侣帮助酶原蛋白折叠。去除前序列, 剩余部分便会形成稳定的中间物, 既不沉淀, 也不折叠;加入前序列,才能折叠成活性构象,将这种序列称为分子内伴侣。与一般的分子伴侣相比, 这种分子内伴侣具有高度的专一性, 通过水解作用释放, 不需要

32、ATP。  分子伴侣的种类分子伴侣的分布很广, 从细菌到人, 动物和植物。在细胞质、线粒体、叶绿体和微体中都有存在。根据同源性分析初步分成10类(表11-2)。表11-2 分子伴侣的分类和分布 分类种属细胞内的定位核质蛋白家族(nucleoplasmins)Nucleoplasmins真核生物细胞核基质Protein XLNO38真核生物细胞核基质Nucleoplasmin S真核生物细胞核基质Hsp70家族Hsp70(Hsp40,Hsp24)所有生物细胞质和细胞骨架，热休克后移至细胞核及核仁质膜上；哺乳动物线粒体DnaK(DnaJ,GrpE)大肠杆菌细胞质Bip哺乳动物内质网Hsc

33、70动物细胞胞浆Hsp60家族GroEL(GroES)大肠杆菌细胞质RBP植物叶绿体TCP1家族TF55古细菌细胞质Tric(TCP1) 真核生物细胞质Hsp90家族Hsp90哺乳动物细胞质Grp94哺乳动物内质网Hsp100家族Hsp104酵母细胞质和核、核仁中ClpX大肠杆菌细胞质分子内伴侣Subtilisin prosequen枯草杆菌细胞质CaroxypeptidaseY prosequence酿酒酵母液泡中周质分子伴侣PulS革兰氏阴性细菌细胞周质空间RNA分子伴侣StpA大肠杆菌细胞类核HNS大肠杆菌细胞类核其它SecB大肠杆菌细胞质  分子伴侣结构上具有哪些共同特点?(

34、 分子伴侣种类很多, 它们在结构上具有哪些共同的特点?（答案） 答: 共同点有:家族成员具有高度保守性 如Hsp70家族是由一类高度保守的蛋白质组成，广泛分布于真核生物和原核生物中。在果蝇、酵母、鸡、哺乳动物、锥虫和细菌等生物细胞中检测发现，甚至在具有最远亲缘关系的真核生物中的Hsp70的序列一致性也达到了50。而原核生物的分子伴侣Dnak与真核生物的分子伴侣Hsp70同源性也高达50。Hsp60家族中大肠杆菌细胞质分子伴侣GroEL与真核生物线粒体基质分子伴侣cpn60的同源性达到60。家族成员结构上具有相似性 如Hsp70家族成员都折叠成两个功能结合区域?ATP结合域和底物结合结构域；结晶

35、X射线分析和电镜观察Hsp60家族中GroEL与cpn60的结构，发现它们都是由十四个相对分子质量60kDa的蛋白质亚基构成两个七元环，再堆叠形成圆筒状的14聚体，中央形成空穴，推测空穴与它们帮助蛋白质折叠的功能有关，可能是提供折叠的场所。组成型表达 家族成员大部分在体内为组成型表达，在刺激条件下会被进一步诱导。Hsp60、Hsp70、Hsp90在细胞内含量丰富，正常情况下GroEL可占细胞总蛋白质含量的12，热诱导下最高可达1015；cpn60占线粒体基质蛋白质总量的1。也有例外，如Hsp70家族成员Hsp72只是诱导产物，正常情况下在细胞中含量很低。这与它们在细胞中所起的作用有关。 家族成

36、员都具有可被底物激活和增强的弱的ATP酶活性 这一特性与它们在作用过程中与ATP结合水解循环过程偶联有关，Hsp70的K依赖的ATP酶活性在它与底物结合时增加220倍。)分子伴侣家族在结构上具有一些共同特点：家族成员具有高度保守性 其中Hsp70家族是由一类高度保守的蛋白质组成，广泛分布于真核生物和原核生物中。在果蝇、酵母、鸡、哺乳动物、锥虫和细菌等生物细胞中检测发现，甚至在具有最远亲缘关系的真核生物中的Hsp70的序列一致性也达到了50。家族成员结构上具有相似性 结晶X射线分析和电镜观察Hsp60家族中GroEL与cpn60的结构，发现它们都是由十四个相对分子质量60kDa的蛋白质亚基构成两

37、个七元环，再堆叠形成圆筒状的14聚体，中央形成空穴(图11-10)，推测空穴与它们帮助蛋白质折叠的功能有关，可能是提供折叠的场所。图11-10 Hsp60 的三维结构组成型表达 家族成员大部分在体内为组成型表达，在刺激条件下会被进一步诱导。家族成员都具有可被底物激活和增强的弱的ATP酶活性 这一特性与它们在作用过程中与ATP结合水解循环过程偶联有关，Hsp70的K依赖的ATP酶活性在它与底物结合时增加220倍。11.3.2 分子伴侣的功能和作用机制分子伴侣广泛分布于各种生物之中, 在蛋白质合成、组装、转运和执行功能的过程中特别是在逆境如高温等条件下起重要作用。  帮助蛋白质折叠和装配

38、这是所有分子伴侣家族成员共同的、最重要的功能。驱使蛋白质折叠和组装的主要作用力是蛋白质疏水区域间的疏水作用。蛋白质多肽链在核糖体上合成时就开始进行折叠。在体内溶液环境中，肽链形成天然构象或亚基装配成复合物之前，它们原来包埋在蛋白质中心的疏水区瞬间会暴露而易错误折叠或聚集形成不正确的产物; 分子伴侣识别这些未折叠的肽链和未组装的亚基，与它们形成复合物防止错误折叠或聚集成包涵体(图11-11)。不同的分子伴侣识别机制和作用专一性不完全相同，如Hsp70家族惟一定位在内质网中的Bip识别内质网蛋白的信号序列。图11-11 分子伴侣在蛋白质折叠和组装中的作用示意图关于分子伴侣GroELGroES帮助蛋

39、白质折叠的机制如图11-12所示，这一模型得到实验的支持，并被普遍接受。图11-12 E.coli分子伴侣GroELGroES在蛋白质折叠中的反应循环（a）1.七元不对称GroELGroES复合物中的GroEL（结合有14分子ADP）的中心穴与未折叠的蛋白质结合，同时释放GroES和14个ADP； 2. GroEL结合14分子ATP,从而减弱了GroEL与蛋白质的结合力，导致GroEL与GroES的重结合；3. 14个ATP分子同时水解，GroEL将结合的未折叠的多肽释放出来，使其进行正确折叠；4. 如果多肽折叠正确即可释放到胞质溶胶中； 5. 如果折叠不正确，则重新经过上述循环再折叠。（b）

40、与GroEL多位点结合的未折叠的多肽在ATP帮助下释放模型。ATP结合及水解使蛋白质多肽与GroEL脱离，并在分离的状态下进行折叠。  帮助蛋白质的转运和定位分子伴侣在蛋白质的转运和定位中起重要作用,它们与新生肽链结合，阻止它们折叠成天然构象或聚集，使新生肽保持输出感受态的构象，即完全或部分折叠并且不被细胞内蛋白酶水解，利于跨膜转位。并且发现在新生肽链进入内质网的共翻译运输的模型中，肽链插入内质网膜除了与信号肽、信号肽识别颗粒和停泊蛋白有关，还与分子伴侣有关。另外在网格蛋白包被小泡形成过程中也需要分子伴侣的帮助。  参与细胞器和细胞核结构的发生 真核细胞中叶绿体和线粒体蛋白

41、是由核基因和细胞器基因共同编码的。核基因编码的蛋白质是在细胞质游离核糖体上合成, 然后转运到叶绿体或线粒体。特别是线粒体的生物合成中, Hsp70和Hsp60的协同作用的结果使线粒体蛋白定位后保持结构的完整和行使正确功能。Hsp70在蛋白前体进入线粒体之前，使它们保持跨膜和对Hsp60的感受态；Hsp60在此之后促进这些蛋白折叠和组装成寡聚体构象，完成整个运输装配过程。 分子伴侣在核小体的装配中起重要作用。核质蛋白是第一个被确定的分子伴侣, 这种酸性可溶蛋白在核中带负电，它只与组蛋白结合，不与DNA或其它装配好的核小体结合。现在认为核质蛋白的负电荷中和组蛋白上正电荷，降低组蛋白电性，减少DNA

42、和组蛋白因离子作用引起的错误装配。  应激反应分子伴侣中除少数成员外，大部分成员均可被高温或低温和乙醇、亚砷酸盐、重金属等非温度因素诱导合成，它们使生物体逆境耐受力大大增强。举例说明分子伴侣在应激反应中的作用。(举例说明分子伴侣在应激反应中的作用。（答案） 答: 这方面的例子很多。如大肠杆菌中DnaK基因缺失严重地降低了细胞在30的生长速度，在40则生长完全被抑制。野生型的大肠杆菌在42条件下预处理5分钟将明显提高菌株在50条件下的存活率。酵母Hsp104基因突变体暴露在50下几分钟其死亡的速率是野生型细胞的1001000倍，同时这种突变体对乙醇的耐受力下降了1000倍。用人类组成型

43、表达的Hsp70基因转化的鼠细胞和猴细胞，明显提高了耐热能力。对于热激蛋白在热休克反应（heat shock response)中的作用机制已研究得比较深入，但还不能准确描述其中关键的生物过程。免疫荧光标记法确定真核生物的Hsp70集中于膜上、核质和核仁中，同时在酵母无细胞提取液中纯化的Hsp70可以修复因热诱导被破坏的核功能如mRNA的剪接。热休克后的果蝇属（Drosophila)生物组成型表达的Hsp70可以加快核形态的恢复，对脊椎动物进行微注射Hsp70可使mRNA在短时热激条件下存活能力提高。热处理主要是破坏mRNA合成、rRNA合成和蛋白质的合成与降解。由此可见分子伴侣在热激反应中的

44、作用首先是恢复细胞转录和翻译的机能。Sherman和Goldberg等人的研究结果表明分子伴侣DnaK等不仅可与变性蛋白结合，阻止它们聚集，还作为蛋白酶酶解的识别要素，使被破坏的蛋白质能被快速降解掉，减少了被破坏的蛋白与功能蛋白间发生有害作用的可能性，防止不溶蛋白聚集积累，同时无功能蛋白质释放的游离的氨基酸可供新的蛋白质的合成。说明分子伴侣不能帮助未折叠的中间物获得正确的折叠途径时，它们就加速中间物的降解，保证体内环境的稳定)  参与信号传导分子伴侣在信号传导中也有重要作用。例如糖皮质(激)素受体(glucocorticoid receptor), 其本身就是一个基因表达的调节蛋白,

45、 在没有激素作用时, 同分子伴侣Hsp90结合, 存在于细胞质中。当细胞受到激素作用后, 激素进入细胞质, 并同受体结合, 使之与伴侣蛋白分开, 这样, 受体可进入细胞核调控基因的表达(图11-13)。图11-13 分子伴侣Hsp70在信号转导中的作用，详见正文。 举例说明分子伴侣是如何参与信号转导?机理如何?( 举例说明分子伴侣是如何参与信号转导?机理如何?（答案） 答: 研究证明, 一些脂溶性信息分子在细胞质中的受体有三个位点：同信息分子结合的位点(hormone binding site)、同DNA结合的结构域(DNA binding domain)以及核定位信号位点(nuclear l

46、ocalization), 所以受体本身就是核定位蛋白。当细胞未受到激素激活时, 受体是同伴侣蛋白结合在一起的, 核定位信号和DNA结合位点都被隐蔽起来。当细胞受到信号分子作用(如激素), 脂溶性的激素进入细胞质, 同相应受体上的激素结合位点结合, 使受体同伴侣蛋白脱离, 露出核定位信号位点和DNA结合位点。然后, 核定位蛋白通过核孔进入细胞核, DNA结合位点同染色体上的DNA结合, 启动基因的表达。 例如糖皮质(激)素受体(glucocorticoid receptor), 其本身就是一个基因表达的调节蛋白, 在没有激素作用时, 同分子伴侣Hsp90结合, 存在于细胞质中。当细胞受到激素作

47、用后, 激素进入细胞质, 并同受体结合, 使之与伴侣蛋白分开, 这样, 受体可进入细胞核调控基因的表达。)11.4 染色质(chromatin)所谓染色质最早是1879年Flemming提出的用以描述核中染色后强烈着色的物质。染色体(chromosome)是细胞在有丝分裂和减数分裂过程中由染色质聚缩而成的棒状结构。 11.4.1 染色质骨架DNA除少数RNA病毒外, DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者, 是遗传信息的一级载体。在真核生物中, 每个DNA分子都被包装到染色体中, 一个生物储存在单倍体染色体组中的总遗传信息称为该生物的基因组(genome)。  DNA的三种构

48、型 染色质中的DNA是双螺旋结构。在构型上,主要是Waston和Crick提出的右手双螺旋DNA, 即B-型DNA。此外还有A型和Z型DNA(图11-14)。 三种DNA构型中, 沟的特征在遗传信息表达过程中起关键作用, 调控蛋白都是通过其分子上氨基酸侧链与沟中碱基对两侧潜在的氢原子供体(=NH)或受体(O和N)形成氢键而识别DNA遗传信息的。另外, Z型DNA同细胞癌变有一定的关系。Z-DNA最初在G和C碱基交替的序列中发现, 但可能在许多嘌呤与嘧啶交替的序列中存在, 在这种情况下, 嘌呤绕糖苷键1800反转, 呈顺式构象, 嘧啶仍保持反式构象。 三种构型的DNA在直径、螺距、旋转角度等方面

49、都有很大的差别(表11-4)。 图11-14 三种不同构型的DNA表11-3 A、B和Z型DNA的比较主要特征螺旋类型ABZ分子外形短粗适中细长螺旋方向右手右手左手螺旋上升值/bp0.29nm0.34nm0.35nm(gc)bp/每圈螺旋10.91012螺距3.2nm3.4nm4.6nm碱基倾角130-2090螺旋轴位置位于大沟, 不穿过碱基对穿过碱基对位于小沟, 穿过碱基对大沟宽而极深宽而略深平坦小沟窄而浅窄而浅窄而深  DNA序列的复杂性真核生物的DNA组织性比较复杂, 根据DNA的复性动力学研究, 可把DNA的序列分为单拷贝和重复序列。单一序列(unique sequence)

50、 又称非重复序列, 在一个基因组中一般只有一个拷贝。真核生物的绝大多数结构基因在单倍体中是单拷贝或几个拷贝(15个拷贝)。重复序列(repetitive sequence)拷贝数在10个以上的序列称为重复序列。根据基因的重复程度, 可以分为两类: 中度重复序列, 重复次数在102 105 之间; 高度重复序列, 重复次数在105 以上。 卫星DNA是高度重复序列中AT含量很高的简单的高度重复序列。由于AT段浮力密度小, 所以在DNA片段进行CsCl密度梯度离心时, 常会在DNA主带上有一个次要的带相伴随, 因此称为卫星DNA。 早期认为重复序列是自私的DNA, 没有什么功能。但随着分子生物学技

51、术的发展, 对重复序列在基因组中的作用的认识越来越深入。我们用复性动力学从水稻基因组中克隆了一个中度重复序列, 总长820bp, 其中存在多个调控元件,通过转基因检测发现不仅具有原核生物启动子活性,而且具有真核生物启动子功能。   DNA结构稳定遗传的功能序列DNA是遗传物质,它的稳定遗传依赖于复制和分离的准确性。真核生物进行有丝分裂和减数分裂时, 首先要进行染色体复制, 然后均等分配到两个子细胞中。根据近年来的研究发现, 要达到这个目的, 在染色体上必须具有三个功能单位, 即: 自主复制序列、着丝粒序列和端粒序列(图11-15)。图11-15 染色体稳定遗传的三种功能序列 ARS

52、序列(autonomous replicating sequence) 即自主复制序列, 又叫复制起点序列(replication origin sequence)。真核生物染色体上有多个ARS序列。上下游各200个bp左右的序列是维持ARS功能所必需的。 CEN 序列(centromeric sequence) 即着丝粒序列，功能是形成着丝粒，均等分配两个子代染色单体。 端粒顺序(telomeric sequence，TEL) 是线性染色体两端的特殊序列，在人类，这种序列是GGGTTA。功能是保持线性染色体的稳定，即不环化、不粘合、不被降解。端粒是由端粒酶合成的。该酶是反转录酶, 自身含有一

53、个RNA分子，可作为延长DNA末端合成的模板，合成的方向是53(图11-16)。图11-16 端粒酶介导的端粒合成端粒酶是一种蛋白和RNA的复合物, 用自身的RNA作为模板, 反转录成DNA, 使DNA链不断加长, 然后在DNA聚合酶的作用下将DNA双链中的未合成的缺口填补。  人工染色体 (artificial chromosome)基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列,人们利用这些序列构建载体, 重组后的DNA以线性状态存在, 这样不仅稳定,而且大大提高了插入外源基因的能力, 并且可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传，称为人工染色体。如利用从酵母染色体上

54、分离的ARS、CEN、TEL序列构建载体，然后用这种载体构建的染色体即称为酵母人工染色体(图11-17)。图11-17 酵母人工染色体的构建11.4.2 组蛋白(histone) 组蛋白的类型和性质组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白, 是一类小分子碱性蛋白质, 有五种类型：H1 、H2A 、H2B 、H3 、H4（表11-4），它们富含带正电荷的碱性氨基酸, 能够同DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。染色质中的组蛋白与DNA的含量之比为1:1。表11-4 五种主要类型的组蛋白类 型赖氨酸精氨酸氨基酸数相对分子质量(道尔顿)H129%1%21523,000H2A11%9%12914,000H2

55、B16%6%12513,800H310%13%13515,300H411%14%10211,200  组蛋白的功能5种组蛋白在功能上分为两组:一组是核小体组蛋白(nucleosomal histone), 包括H2A、H2B、H3和H4,它们的作用是将DNA分子盘绕成核小体。H1属于另一组组蛋白, 它不参加核小体的组建, 在构成核小体时起连接作用, 并赋予染色质以极性。5种组蛋白在结构和功能上有什么异同?( 5种组蛋白在结构和功能上有什么异同?（答案） 答: 组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白, 是一类小分子碱性蛋白质, 有五种类型：H1 、H2A 、H2B 、H3 、H4（表11

56、-4），它们富含带正电荷的碱性氨基酸, 能够同DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。5种组蛋白在功能上分为两组:一组是核小体组蛋白(nucleosomal histone), 包括H2A、H2B、H3和H4, 这四种组蛋白相对分子质量较小(102135个氨基酸残基), 它们的作用是将DNA分子盘绕成核小体。它们没有种属及组织特异性, 在进化上十分保守, 特别是H3和H4是所有已知蛋白质中最为保守的。H1属于另一组组蛋白, 它不参加核小体的组建, 在构成核小体时起连接作用, 并赋予染色质以极性。H1有一定的组织和种属特异性。H1的相对分子质量较大, 有215个氨基酸残基, 在进化上也较不保守)&#

57、160; 组蛋白的化学修饰大多数细胞中都有部分组蛋白的某些碱性氨基酸侧链被磷酸化、乙酰化或甲基化以及ADP的核糖化等修饰(图11-18), 这些修饰中和了侧链的正电荷或被转变成带负电。图11-18 组蛋白的修饰作用11.4.3 非组蛋白(nonhistone proteins)与染色体组蛋白不同, 非组蛋白是指细胞核中组蛋白以外的酸性蛋白质。非组蛋白不仅包括以DNA作为底物的酶，也包括作用于组蛋白的一些酶, 如组蛋白甲基化酶(表 11-5)。表11-5 某些具有酶功能的非组蛋白酶功能以核酸作为底物的酶DNA聚合酶DNA合成RNA聚合酶RNA合成核酸酶切割DNA和/或RNADNA连接酶在DNA复制和修复时进行DNA连接Poly-A聚合酶在mRNA3添加poly A尾DNA甲基化酶DNA甲基化拓扑异构酶将超螺旋DNA转变成松弛