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文档简介

1、欧阳物创编2021.02.07实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量时间：2021.02.07命题人：欧阳物、试验目的1. 学习分光光度计的原理及操作2. 学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光 度法检测灵敏度二、基本原理1. 根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为 吸收光谱法或分光光度法。该法所用的仪器称为分光光 度计或吸收光谱仪。该法所使用的光谱范围包括可见光和 紫外光*即包括波长在200 - 800 nm之间的光。2. 分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中 的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必 不可少的基本手段之一。3. 紫外区可分为紫外（近

2、紫外）和真空紫外（远紫外）。由 于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气欧阳物创编2021.02.07能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在 近紫外区，即200nm-400nm °可见光区为400nm -800nm °4老马斯亮蓝G250法原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nmz该蛋白染料复合物吸光系 数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定lig /mL的蛋 白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳 定。操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。 去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定三、试剂1.

3、 标准蛋白质溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液2. 老马斯亮蓝G250蛋白染色剂：四、操作步骤1. 标准曲线的绘制：取6只试管，分别加入浓度为0，0.1，0.2 0.3，0.4，0.5mg/ml的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马 斯亮蓝试剂，震荡混勻，2分钟后于595nm测定吸光值， 以蛋白质浓度为橫坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲 线。2样品测定：样品液0.1mLz然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混 欧阳物创编2021.02.07欧阳物创编2021.02.07勻，2分钟后于595nm测定吸光值。从标准曲线中查出 相应的浓度。五、试验结果1数据记录标准蛋白质溶液浓度mg/ml00020.30.40.5C吸光度A00.0210.0370.0560.0700070.0172 标准曲线的绘制3 样品的测定根据标准曲线可以找出样品对应的点（0.085，0.017 ），所 以样品的浓度为0.085mg/ml。六结果讨论注意事项：1 分光光度计必须放置在固定而且不受震动的仪器台上， 不能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。2. 盛待测液时，必须达到比色杯2/3左右，不宜过多。若 不慎使溶液流出比色杯外面，必须先用滤纸吸干，再用擦 镜纸或绸布擦净才能放入比色杯槽内。移动比色杯槽要 轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。3千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯光滑面。4. 用完比色杯后应

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