甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究

1、甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究               作者：杨晓芳, 江滟, 李婉宜, 邝玉, 蒋忠华, 王丰平, 李明远【摘要】  目的: 构建真核表达重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB, 并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法: 重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因, 将扩增得到的融合基因片段M2eCtB定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1a(+)中,

2、再转化E.coli JM109。将酶切鉴定、 PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)M2e/CtB。用KEGEN TRANS 阳离子聚合物将重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB转染NIH3T3细胞, 经免疫荧光、 RTPCR产物序列分析、 Western blot检测其稳定表达产物。结果: 重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因, 与相对应基因的序列同源性分别为100%。重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达, 并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18000的蛋白条带。结论: 成功

3、构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB, 初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外, 且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性, 为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础。 【关键词】  甲型流感病毒 M2e 黏膜免疫佐剂 霍乱毒素B亚单位 融合蛋白Abstract  AIM: To construct the eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1a(+)M2e/CtB which contains H1N1 M2e gene and cholera toxin B subunit gene (CtB

4、) and to study the expression and immunity of recombinant protein M2e/CTB in NIH3T3 cells. METHODS: M2e/CtB gene was cloned by PCR and digested with Hind and Xho . M2e/CtB was linked into pcDNA3.1a(+) to build eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1a(+)M2e/CtB. The pcDNA3.1a(+)M2e/CtB was transfered

5、into competent E.coli JM109. The transformed colonies were verified by Hind and Xho , PCR, and sequencing. The NIH3T3 cells were transfected with pcDNA3.1a(+)M2e/CtB by positive ion polymer. The product of M2e/CtB gene with stable expression was analysed by immunofluorescence, RTPCR sequencing, and

6、Western blot. RESULTS: The digested pcDNA3.1a (+)M2e/CtB contains correct M2e and CtB gene. Blastn results showed the genetic homongenicity of M2e and CtB were 100%, respectively. The pcDNA3.1a(+)M2e/CtB efficiently expressed M2e/CTB protein in the eukaryotic NIH3T3 cells. The cell lysis and superna

7、nt both contained the M2e/CTB protein, which had the immunity and reactivity to both antiM2e and antiCTB. The Mr of M2e/CTB protein was about 18 000 analysed by Western blot. CONCLUSION: A new recombinant eukaryotic plasmid pcDNA3.1a(+) M2e/CtB has been successfully constructed. The plasmid can expr

8、ess the fused protein of M2e with CTB. Our study will help further research into new and effective DNA vaccines against influenza virus A.Keywordsinfluenza virus A; M2e; mucous immunoadjuvant; CTB; fused protein自1918年世界流感大流行以来, 流感病毒仍持续对人类健康造成危害, 对造成重大损失。流感疫苗一直是人们依赖的抗流感武器, 但遗憾的是现有疫苗多以当前流行的流感病毒为防疫对象,

9、一旦流感病毒发生变异, 这些疫苗也无济于事。因此研发一种能防治多株流感病毒的保护性疫苗迫在眉睫。流感病毒有3种膜蛋白, 分别是血凝素(HA), 神经氨酸酶(NA), 基质蛋白(M2), 其中仅HA和NA均易发生变异, 而M2蛋白的胞外区(M2e)在流感病毒株间是高度保守的。霍乱毒素B亚单位(CTB)是目前研究发现的一种新型黏膜免疫佐剂, 同时也是霍乱弧菌主要的保护性抗原。此研究正是基于M2e的保守特性, 将M2e与CTB进行融合表达并研究此融合蛋白的表达特性和免疫学特性, 为今后深入研究具有交叉保护作用的抗流感病毒的核酸疫苗打下坚实基础。1  材料和方法1.1  材料

10、60; 含流感病毒H1N1 (A/PR/8/34) M2e基因的质粒pcDNA3.1a(+)M2e由本室王丰平硕士构建, 含CtB基因的质粒pET32a(+)CtB/ure I由本室王保宁博士构建; pcDNA3.1a(+)和E.coli JM109, NIH3T3细胞由本室保存。兔抗流感病毒多克隆抗体由本室制备; 马抗霍乱毒素多克隆抗体由药品生物制品检定所提供。DNA限制性内切酶、 T4 DNA连接酶, PCR试剂盒及RT试剂盒购自Fermentas公司; 质粒小量提取试剂盒购自Omega公司; KEGEN TRANS 阳离子聚合物转染试剂购自南京凯基公司; FITC荧光标记的羊抗兔二抗Ig

11、和HRP标记的羊抗兔Ig、 兔抗马Ig二抗购自博奥森公司; Western blot DAB显色试剂盒购自中杉公司; 硝酸纤维膜购自PALL公司; 小鼠actin特异引物1和2购自Invitrogen公司。1.2  方法1.2.1  M2e/CtB基因真核表达质粒的构建  (1)M2e/CtB基因的体外扩增:根据pcDNA3.1a(+)M2和pET32a(+)CtB/ure I分别设计了两对引物M1、 M2和C1、 C2, 扩增包括M2e和CtB基因(分别为72 bp和375 bp)完整的开放阅读框架。M2和C1的5端含反向互补12 bp连接肽序列。两对引物及包含

12、的酶切位点和连接肽如下: M1为5CTAAGCTTAACATGAGTCTTCTAACCGAG3(Hind ), M2为5ACCGCCACCGCCATCACTTGAACCGTTG3; C1为5GGCGGTGGCGGTATGATTAAATTAAAATTTGGTGT3, C2为5CGCCTCGAGCGTTAATTTGCCATACTAATTG3(Xho)。引物由Invitrogen公司合成, M2e和CtB基因 PCR反应条件:  94预变性4 min, 94 30 s, 58 30 s, 72 40 s, 30个循环后72延伸10 min。M2e和CtB基因PCR扩增产物作为模板, 加入引

13、物M1和C2扩增融合基因M2e/CtB, PCR反应条件: 94预变性4 min, 94 30 s, 55 30 s, 72 40 s, 30个循环后72延伸10 min。(2) M2e/CtB基因的重组和鉴定: M2e/CtB基因的PCR扩增产物和pcDNA3.1a(+)经Hind 和Xho酶切处理后分别进行回收, 经T4 DNA连接酶连接后, 转化入E.coli JM109中经Amp筛选得到阳性重组子。提取质粒对目的基因作限制性酶切鉴定, PCR鉴定和序列鉴定, 构建的真核表达质粒命名为pcDNA3.1a(+)M2e/CtB。1.2.2  M2e/CtB基因的体外表达 

14、 (1)转染NIH3T3细胞和稳定筛选转染阳性NIH3T3细胞: 6孔板中每孔接种5.5×105个NIH3T3细胞, 转染前细胞融合度达70%。制备并纯化重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB, 按KeGenTrans 转染试剂说明进行质粒转染操作, 37、 50 mL/L CO2孵箱孵育。转染孔细胞换用含G418(400 mg/L)的DMEM完全培养液继续培养, 每3 d更换1次培养液至空白对照孔细胞完全死亡。继续用含G418 (400 mg/L)的DMEM完全培养液培养, 出现阳性克隆时转至培养瓶中扩大培养。(2)免疫荧光检测: 将稳筛阳性细胞于6孔板中培养, 制作细胞爬

15、片。当爬片上细胞融合度达50%70%时, 按免疫荧光常规操作, 兔抗流感病毒抗体和马抗霍乱毒素抗体的使用浓度为1100, 在4过夜, 洗涤后再加FITC标记的羊抗兔二抗, 室温下反应1 h。荧光显微镜下观察结果, 阳性即表示目的蛋白表达。(3)RTPCR检测及序列分析: 将稳筛阳性细胞培养瓶中培养, 待细胞生长至完全融合时, 收集细胞按TRIzol细胞裂解液试剂说明对收集的细胞进行裂解操作, 提取总RNA进行RTPCR1, 反应条件为94预变性4 min, 94 30 s, 60 30 s, 72 40 s, 30个循环后72延伸10 min。将PCR扩增产物纯化后送Invitrogen公司测

16、序。(4)Western blot检测: 将稳筛阳性细胞于培养瓶中扩大培养, 待细胞生长至完全融合时, 分别收集细胞和培养液。将5 mL培养液以12000 r/min离心5 min, 取上清, 用100 mL/L聚乙二醇4透析3 h, 浓缩为1 mL。用三去污剂细胞裂解液对收集的细胞进行裂解, 离心收集上清。取制备好的蛋白样品, 加6×SDS上样缓冲液, 混匀, 100处理5 min, 取20 L进行SDSPAGE电泳(分离胶浓度为120 g/L), 电泳后用湿转法转印到硝酸纤维(NC)膜上, 按常规进行Western blot显色2。用50 g/L脱脂奶粉封闭液封闭2 h, 分别加

17、1100的兔抗流感病毒一抗和1100的马抗霍乱毒素一抗, 4过夜, 再分别加15000 HRP标记的羊抗兔和马抗兔二抗, 室温振摇孵育1 h, 用DAB显色。2  结果2.1  重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB的酶切鉴定  重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB用Hind和EcoR进行双酶切, 得到一个载体大片段和约480 bp的插入小片段（图1）。图1  重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB的酶切鉴定（略）Fig 1  Restriction analysis of recombinant plasmid pc

18、DNA3.1a(+)M2e/CtB1: Plasmid pcDNA3.1a(+); 2: pcDNA3.1a(+)M2e/CtB digested by Hind ; 3: pcDNA3.1a(+)M2e/CtB digested by Hind and Xho ; M: DNA marker.2.2  重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB的PCR鉴定  以酶切鉴定正确的重组质粒DNA为模板, 分别以引物M1和C2进行PCR扩增, 得到约480 bp大小的片段（图2）。图2  PCR鉴定重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB（略）Fig 2

19、60; PCR analysis of recombinant plasmid pcDNA3.1a(+)M2e/CtB1: PCR product of pcDNA3.1a(+)M2e/CtB; 2: DNA marker .2.3  M2e/CtB融合基因序列测定结果  克隆M2e/CtB融合基因全长为459 bp, 其中M2e基因长度为72 bp, CtB基因长度为375 bp, 二者之间为12 bp的连接肽基因序列。与GenBank中M2基因和CtB基因序列相比较, 一致性为100%, 表明所克隆M2基因和CtB基因序列正确。2.4  检测重组质粒在细胞中的

20、表达2.4.1  免疫荧光检测  在荧光显微镜下可见转染细胞膜和细胞内有较强的绿色荧光, 且转染细胞阳性率近100%, 表明成功转入细胞, 并在细胞膜和细胞内获得表达, 稳定筛选转染阳性细胞成功。空质粒pcDNA3.1a(+)转染的细胞未检测到绿色荧光（图3）。图3  免疫荧光法检测重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB(A)(B)和空质粒pcDNA3.1a(+)(C)(D)在NIH3T3细胞中的表达（略）Fig 3  Immunofluorescence analysis of the stable expression product of

21、recombinant plasmid pcDNA3.1a(+)M2e/CtB (A)(B) and plasmid pcDNA3.1(+)(C)(D) in NIH3T3 cellA, C: Viewed under immunofluorescence microscope; B, D: Viewed under  microscope.2.4.2  RTPCR检测与测序分析  转染阳性NIH3T3细胞总RNA为模板, M1和C2为引物, 扩增出了约480 bp基因片段, 对照actin基因片段为291 bp（图4）。RTPCR产物测序结果与GenBank中M

22、2基因和CtB基因序列相比较, 一致性为100%, 表明稳定筛选出的阳性细胞株可转录出正确的目的基因mRNA。1         图4  RTPCR检测重组质粒在NIH3T3细胞中的表达（略）Fig 4  RTPCR products of recombinant plasmids by primers M1, C2, 1 and 21: pcDNA3.1a(+); 2: pcDNA3.1a(+)M2e/CtB; M: DNA marker .2.4.3  Western blot检测

23、  细胞总蛋白和培养液上清5倍浓缩样品均在Mr约18000处检测到阳性杂交信号。M2e蛋白和CTB蛋白Mr分别是4000和13700, 表明pcDNA3.1a(+)M2e/CtB在细胞内表达的M2e/CTB融合蛋白大小与预期结果一致。空质粒pcDNA3.1a(+)转染的细胞样品与细胞培养液上清未检测到杂交信号(图5)。图5  重组质粒转染稳筛的细胞和培养液上清Western blot检测（略）Fig 5  Western blot analysis of the stable expression product of recombinant plasmid pc

24、DNA3.1a(+)M2e/CtB1, 7: The culture supernant of plasmid pcDNA3.1a(+); 2, 8: Plasmid pcDNA3.1a(+) stable transfected NIH3T3 cells lysate; 3, 5:  The culture supernant of plasmid pcDNA3.1a(+)M2e/CtB; 4, 6: Plasmid pcDNA3.1a(+)M2e/CtB stable transfected NIH3T3 cells lysate; 1-4: Exposed to anticho

25、lera toxin polyclonal antibody;  5-8: Exposed to antiH1N1 polyclonal antibody.3  讨论    具有交叉保护作用的流感疫苗一直是流感疫苗研究的热点, M2蛋白因其保守特性备受研究者关注。M2蛋白由97个氨基酸组成, 是一种不含糖基的跨膜四聚体蛋白3, 具有质子泵转运功能4。M2蛋白在病毒颗粒胞膜上呈低密度表达, 平均每个病毒颗粒上有10个M2四聚体, 却有500个血凝素三聚体, 100个神经氨酸酶四聚体; 但在感染细胞的胞膜上M2却是高密度表达的, 与HA的密度相似。

26、M2e含23个氨基酸, 在它的N端有9个氨基酸是完全保守的, 但它的近膜端15个氨基酸可有很轻微的结构变化5。有研究发现, 抗M2的多克隆抗体(14C2)在体外和体内实验中均能抑制流感病毒复制6, 含M基因片段质粒接种实验动物也能诱导产生很好的免疫保护作用7。还有人用合成的M2e多肽经滴鼻接种小鼠后, 也能诱导小鼠产生很明显的流感病毒抵抗力8。CTB是目前认为能提高免疫原性的最安全有效的黏膜佐剂之一, 能结合到体内的M细胞上, 增强M细胞对抗原的转运, 并提高黏膜上皮下面的巨噬细胞对抗原的摄取, 促进Th2型免疫应答, 增强sIgA及全身IgG的产生9。AsahiOzaki等用CTB与灭活的重

27、组H5N1流感病毒同时经鼻免疫接种小鼠, 可在小鼠鼻腔灌洗液和血清中分别检测到抗H5N1的sIgA和IgG, 并且可使小鼠有效抵抗致死剂量H5N1(HK483)的攻击感染10。    我们在本研究中克隆得到的M2e基因片段经2次测序证实其正确率为100%, 为确保M2e蛋白的一级结构和生物学活性打下了基础。我们将M2e基因与完整的CTB基因进行融合表达, 中间采用四个甘氨酸作为连接肽, 目的是保留M2e与CTB各自的空间构象与生物学活性。通过稳筛细胞株的免疫荧光检测, RTPCR及测序分析, Western blot等试验的结果说明重组质粒在真核细胞中可转录出正确

28、的M2eCtB mRNA, 并且能释放出具有完整抗原性的分泌性M2e/CTB融合蛋白。    本研究中所构建的含目的片段的重组质粒未另行添加信号肽序列, 然而细胞上清中仍含有M2e/CTB融合蛋白, 分析可能是以下几种非经典分泌途径之一: (1)蛋白在胞质中被合成后进入囊泡, 通过囊泡运输到胞外11; (2)蛋白合成后在载体蛋白的协助下运输到胞外12; (3)蛋白合成后直接聚集到胞膜下, 随后形成与胞膜结合的囊泡而运输到胞外13; (4)蛋白合成后定位到细胞内膜, 通过膜的翻转运输到胞外14。非经典途径的分泌蛋白在分泌前已经在细胞质中完成折叠, 形成成熟的构象,

29、分泌过程不需要蛋白去折叠15, 有利于蛋白形成正确的构象和高效行使正常的功能。M2e/CTB融合蛋白的非经典分泌特性使其有可能在体内更有效地激活免疫系统, 是很好的核酸疫苗候选蛋白。我们将在进一步的研究中继续探索基于融合蛋白M2e/CTB的核酸疫苗在小鼠动物体内抗流感病毒感染中的保护作用,为本疫苗的逐步应用奠定坚实的实验基础。【】  1 魏晓丽, 施桥发, 李 虹, 等. 鼠2防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定J. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(1): 28-31.2 王保宁, 杨晓芳, 施乔发, 等. ctb和ure I双基因融合表达及其免疫特性分析J. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(3): 276-279.3 Sugrue RJ, Hay AJ. Structural characteristics of the M2 protein of influenza A viruses: Evidence that it forms a tetrameric channelJ. Virology, 1991, 1