白细胞介素6单克隆抗体的研制

1、    白细胞介素6单克隆抗体的研制        摘要采用纯化的工程菌表达产物白细胞介素6（Interleukin6，IL-6）免疫BALBC小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP20）在PEG作用下进行融合，通过ELISA筛选并多次亚克隆，获得了1株能分泌抗IL-6单克隆抗体的杂交瘤细胞Ic-1345。Westernblot显示：抗体结合抗原的分子量与IL-6相符，为特异性抗IL-6抗体。亚类鉴定表明：该细胞分泌的单克隆抗体为IgG1亚类，kappa型。染色体数目为100条

2、左右。腹水效价为1104，无血清培养液效价为1102。此杂交瘤细胞株体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体滴度无明显降低。关键词IL-6单克隆抗体杂交瘤中号R392.11 THE PREPARATION AND PRELIMINARY DETERMINATION OF ANTI-IL-6 MONOCLONAL ANTIBODYChen Lin，Xu Xiuying，Bian Jiang，Yu Fang，Huang Peitang（Institute of Biotechnology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071）Ab

3、stract Balbc mice were immunized with interleukin 6（IL-6）antigen purified from engineered Ecoli strain，their spleen cells were fused with myeloma cells by polyethyleneglyco（PEG）After making ELISA screening and subcloning we obtained one positive hybridoma cell strain Ic-1345Western blot demonstrated

4、 that antibody was peculiar to combine with IL-6 antigenThe monoclonal antibody was IgG1 subclass，kappa typeChromosomal numbers were 100 or soWe cultivated and frozen cells，prepared ascetic fluid and serum-free supernatantThe titer of ascetic fluid was 1104 and serum-free supernatant was 1102The hyb

5、ridoma cell was bequeathed more than six months and the  titer of antibody had not obviously changedKey words Interleukin 6，Monoclonal antibody，Hybridoma白细胞介素6（IL-6）主要是由单核-吞噬细胞产生，有多种生物学活性功能的细胞因子。它具有诱导淋巴细胞分化增殖、调节机体的免疫应答、促进造血细胞的分化和抗肿瘤的特性。临床一些疾病的发生和发展与IL-6有密切关系1。文献报道，临床上许多疾病患者体液中IL-6水平有所提高23。目前国内对

6、IL-6的研究已比较深入，尤其在IL-6基因重组表达方面进展很快。IL-6抗体的研制为IL-6的检测、鉴定、纯化提供了方便。本文用PEG作为融合剂，使骨髓瘤细胞（SP20）与免疫的脾细胞融合，获得了1株分泌抗IL-6单抗的杂交瘤细胞Ic-1345。我们将细胞冻存，同时制备细胞无血清培养上清及小鼠腹水，并对该单抗进行了亚类鉴定及特异性鉴定。1 材料与方法1.1 材料PEG 4000：Serva产品；小鼠骨髓瘤细胞（SP20）：本组保存；IL-6抗原：为表达人重组白细胞介素6的大肠杆菌发酵、纯化产品4；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG：Promega产品；BALBC小鼠：812周龄，雌性，按二级动

7、物喂养，由本院动物中心提供；RPMI 1640干粉：GIBCO产品；无支原体小牛血清：浙江杭州四季青生物工程材料研究所生产；仪器：细胞培养成套仪器，SS-3000酶联仪，电泳仪，电转移装置。1.2 方法1.2.1 动物免疫：将200gIL-6抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，充分乳化，经腹腔注射免疫BALBC小鼠。加强免疫则采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。融合前3d，经尾静脉注射同等剂量的抗原生理盐水溶液。1.2.2 融合1.2.2.1 制备BALBC小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞。1.2.2.2 将小鼠脾细胞与SP20细胞按51比例混合于50ml尖底离心管中，置于37°C水浴中，于4

8、5s内缓慢滴入1ml 50PEG，静置1min，用GKN终止，离心收集细胞。将细胞悬于含HAT的选择培养基中，接种于96孔培养板中。1.2.3 ELISA检测：采用间接ELISA法筛选分泌抗体阳性杂交瘤细胞。1.2.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆：采用有限稀释法进行。1.2.5 细胞冻存：按常规法进行。1.2.6 杂交瘤细胞无血清培养液及腹水制备：1.2.6.1 通过亚克隆获得的单克隆杂交瘤细胞在细胞瓶中长满单层后，用无血清培养液洗1次，再加入无血清培养液培养，3d后收上清。1.2.6.2 小鼠腹腔接种福氏不完全佐剂0.30.4ml只，714d后，经腹腔接种105106杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大，

9、抽取腹水，20°C保存。1.2.7 抗体特异性鉴定5：抗原经SDS-PAGE后，通过电转移装置将其转移至硝酸纤维素膜上。将膜浸泡于杂交瘤细胞上清中，再加入酶标二抗作用底物DAB显色。同时以抗原与蛋白分子量标准品电泳、考马斯亮蓝染色后脱色结果为对照。1.2.8 亚类鉴定：采用ELISA酶标抗体法鉴定。1.2.9 染色体检查：在细胞培养基中加入终浓度为0.3gml的秋水仙素，于37°C继续培养2h，收集细胞，加0.075molL KCl，37°C保温30min。用甲醇与冰醋酸混合液（两者比例为31）固定3次，制片，Giemsa染色。2 结果与讨论2.1 融合率 计数生

10、长杂交瘤细胞的孔数，计算其与接种杂交瘤细胞的孔数之比，获得融合率为4。融合过程中，滋养细胞生长状况的优劣、融合的时间、PEG的分子量及其pH等多种因素均影响细胞的融合效率。2.2 阳性率 经多次测定杂交瘤细胞阳性率为19。2.3 ELISA检测3次亚克隆的杂交瘤细胞上清 阳性率达100（见1）。1杂交瘤细胞3次亚克隆后ELISA检测结果Fig 1The ELISA results of hybridoma cell subclone for three times1：A2：Blank； 2：B2：Negative control； 3The rest：Sample2.4 测定抗IL-6单克隆抗

11、体效价2.4.1 将杂交瘤细胞接种于预先致敏的小鼠腹腔，获得腹水并用ELISA测定抗体效价为1104。2.4.2 细胞无血清培养液培养3d，收上清测定抗体效价结果为1102。2.4.3 该杂交瘤细胞3d传一代，体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体效价无明显降低。2.5 Western blot结果表明，抗体能与转移至硝酸纤维素膜上的抗原结合，通过酶标二抗作用后使底物显色，其结合抗原的分子量与工程菌表达的IL-6分子量一致，证明该细胞分泌的单抗能与IL-6结合（见2）。2 Western blot结果Fig 2 The results of Western blot1：IL-6； 2：Re

12、duced IL-6； 3：Molecular weight standard：97400 66200 42700 31000 14400； 4：The result of Western blot for IL-6；5：The result of Western blot for reduced IL-62.6 抗体亚类及型的鉴定 用ELISA法鉴定抗体为IgG1亚类、kappa型。2.7 染色体检查结果 染色体条数为100条左右，杂交瘤细胞染色体数为脾细胞与SP20细胞染色体数目之和，表明它们是融合产生的杂交瘤细胞（见3）。3 杂交瘤细胞染色体Fig 3 The chromosomal m

13、orphology of hybridoma cellIL-6是机体内具有多种调节功能的因子。体内IL-6水平的异常变化与多种疾病有关。采用细胞生物活性法6测定体液及工程菌表达的IL-6水平工作量大且费用高。我们用传统的细胞融合技术7，通过亚克隆、筛选获得了1株分泌抗IL-6单抗的杂交瘤细胞。抗体亚类鉴定为IgG1。IL-6单抗制备成功为临床和基础相关研究提供了方便。作者单位:陈琳徐秀英边疆于芳黄培堂军事医学科学院生物工程研究所北京100071第一作者：陈琳，女，33岁，大专，实验师参考文献1 Hirano T，Akira S，Taga T，et alBiological and clinic

14、al aspects of interleukin 6Immunol Today，1990，11（12）：4432 Van Oers MHJ，Van Der Heyden AAPAM，Aarden LA，et alIL-6 in serum and urine of renal transplant reci-pientsC1in Exp Immunol，1988，71：3143  Honda M，Kitamura K，Mizutani Y，et alQantitative analysis of serum IL-6 and its correlation with increased levels of serum IL-2R in HIV-induced diseasesJ Immunol，1990，145（2）：40594 边 疆，陶好霞，薛 冲，等.重组人白细胞介素6的制备.生物工程进展，1995，15（6）；335 Towbin H，Staehelin T，Gordon JElectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets；procedure and some applicationsProc Nat1 Aca Sci US