深黄被孢霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因的原核表达和转基因植株再生研究

1、深黄被孢霉6脂肪酸脱氢酶基因的原核表达和转基因植株再生研究         09-09-25 11:23:00     编辑：studa20                   作者：王广科, 李明春, 李晋川, 刑来君【摘要】  目的 通过农杆菌介导法将来源于深黄被孢霉的6脂肪酸脱氢酶(D6D)基

2、因导入到东北大豆绥农10和吉林47中，最终获得转基因植株。方法 利用子叶节外植体诱导出丛生芽和再生植株，利用卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选以及PCR方法、DNA分子杂交分析和GC分析检测转基因植株中的6脂肪酸脱氢酶基因表达状况。结果 经过含50 mg/L卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选，获得了一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分析，初步证明6脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中。将转基因大豆T1代和T2代种子进行脂肪酸GC分析，结果在大豆种子中检测到6脂肪酸脱氢酶基因的产物GLA，证明该基因在大豆中得到了表达。 【关键词】  6脂肪酸脱氢酶基因； 大豆； 农杆菌介导

3、转化； 脂肪酸GC分析； 转基因植株    【Abstract】  Objective The 6fatty acid desaturase genes from Mortitieralla isabellina were introduced into suinong10 and  jilin47 via Agrobacterium infection method, some transgenic soybean were obtained. Methods Adentitious buds and regenerated plants w

4、ere inducted from cotylendon nodes, Kanamycin resistant culture medium, PCR Southern blot and GC analysis detected condition of the 6fatty acid desaturase genes of transgenic plants. Result Kanamycin resistant(Kmr) transgenic plants were obtained by screening in selective condition. PCR and Southern

5、 blot analysis from transgenic plants proved that the 6fatty acid desaturase genes were transferred and integrated into soybean genomes. Total fatty acids extracted from the positive transgenic soybean were analyzed by gas chromatography (GC) of methyl esters to confirm the transgenic soybean contai

6、ning a functional 6fatty acid desaturase gene. The presence of GLA indicated that the 6fatty acid desaturase genes from Mortitieralla isabellina were expressed in transgenic soybeans.    【Key words】  6fatty acid desaturase gene;Soybean(Glycin max L.);Agrobacteriummediated transfo

7、rmation;GC analysis of fatty acid;transgenic plant     GLA是多烯不饱和脂肪酸1（Polyunsaturated Fatty Acid，PuFA）n6代谢路线中的一种重要的脂肪酸1，它作为人体必需脂肪酸（Essential fatty acid，EFAs），对人体具有双重功能，既是人体的必需营养元素，又是治疗疾病的重要药物。它在人体中可以转化为二高亚麻酸（DGLA）和花生四烯酸（AA），二者是合成前列腺素类物质的前体,对人体的激素调节及脂肪酸代谢发挥着重要的生理作用2。所以由GLA开始的一系列相关不

8、饱和脂肪酸的研究将会在医药学、营养学、生物学等方面展开一个新的、更广阔的研究领域3。从亚油酸到亚麻酸是由6脱氢酶催化的，6脱氢酶是以亚油酸为底物，在C6位上脱氢形成GLA.然后，通过碳链延长和脱氢作用，进一步形成花生四烯酸、前列腺素和白三烯类等生理活性物质。由于6脱氢这一步是 GLA形成的限速步骤，而且是由D6D催化的，因而D6D是GLA合成的关键因素4,5。近年来，先后报道了从高山被孢霉中分离出6脂肪酸脱氢酶，并分别在酵母、米曲霉和烟草中获得功能性表达。    大豆是主要的油料作物之一，富含亚油酸，而不含亚麻酸或含量极低。本实验室从1989年开始研究微生物发酵生

9、产亚麻酸。近年来，对产亚麻酸的关键酶6 脂肪酸脱氢酶进行了克隆和序列分析，从高产亚麻酸的深黄被孢霉菌株中克隆出6脂肪酸脱氢酶的结构基因，是世界上第十个克隆出该基因的实验室，在GenBank中的序列接收号为AF307934，并在酵母和烟草中得到表达69，这为将该基因转化到大豆中提供了前提和基础。本实验采用农杆菌介导的转化方法，将该基因转化到东北大豆品种绥农10和吉林47两个品种中，得到了一批转基因植株。    1  材料与方法    11  植物材料    绥农10和吉林47等两个优良品

10、种，由吉林省农科院大豆研究所提供。    12  菌株与质粒    Agrobacterium tumefaciens LBA4404，由中科院微生物所方荣祥先生馈赠。pGA643（Kanr），由内蒙古大学哈斯阿古拉教授惠赠。pTMICL6（Ampr）（全长MI D6D cDNA），南开大学真菌实验室保存。    13  主要试剂    UNIQ10柱式多用途DNA纯化试剂盒、dNTP Mix、上游引物9651、下游引物w21500均购自上海Sangon公

11、司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、卡那霉素、利福平和链霉素等主要购自华美生物工程公司、宝生物公司；地高辛标记和检测试剂盒购自德国Roche公司；Taq DNA聚合酶、Taq DNA plus 购自鼎国生物技术有限公司；亚麻酸（GLA）标准品购自Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。    14  培养基的配制    LB、YEB、MS及MSB培养基配方参见文献10。    15  抗生素与激素的配制    配制方法参见文献10。  

12、  16  植物表达载体的构建及农杆菌的转化    参照文献10的分子克隆方法构建出含有6脂肪酸脱氢酶基因的pGMICL6表达载体，将该表达载体经电转化到LBA4404根癌农杆菌中。    17  农杆菌的培养    从保存的农杆菌平板上挑取含有表达载体的单菌落，接入含有50 mg/L Kan、25 mg/L Rif、25 mg/L Str的YEB培养基中，28，145 r/min振荡培养。    18  农杆菌介导6脂肪酸脱氢酶基因转

13、化大豆    挑取无病斑且种皮完好的大豆种子，清水浸泡过夜后去种皮，置于1/2 MSB 或MS固体培养基培养，几天后获得无菌苗。切取子叶节外植体并制造伤口并农杆菌菌液感染，感染后置于幼芽固体培养基中诱导分化出芽。待抗性芽在伸长培养基中长到34 cm后转到生根培养基中，1520 d后可得到大豆转基因抗性小植株，当根充分发育后，将幼苗移栽到花盆。抗性再生苗在花盆里两个月开始结籽，收获后，对部分子1代的种子进行脂肪酸组成和含量的测定，其余种子种于温室中，即为T1代转基因植株。    19  转基因植株的PCR检测 

14、60;  取卡那霉素筛选过的转基因植株，用CTAB法提取总DNA，用于PCR扩增6脂肪酸脱氢酶基因。上游引物序列P1(9651)：5GGCTTCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGT3（Xba）;下游引物序列P2(W21500)：5CTGCAGATCTTTACTGCGCCTTACC3(Bgl)。反应条件：94 5 min94 1 min53 1 min72 2 min35cycles72 10 min.    110  转基因植株的Southern检测    大量提取PCR反应阳性大豆转基因植株的总DNA，Hind单酶切后经过电泳及转膜步骤与地高辛标记的6脂肪酸脱氢酶基因的探针杂交，具体步骤见杂交试剂盒说明书。    111  转基因大豆脂肪酸的气相色谱（GC）分析    取一粒转基因阳性大豆种子，提取脂肪酸后进行气相色谱（GC）分析，气相色谱测定由南开大学中心