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1、 制半夏抑制基质金属蛋白酶活性及抗肿瘤机理的实验研究作者:戈宏焱 杨金刚 房学讯 赵树华 李有田【摘要】 目的研究制半夏对基质金属蛋白酶-16(MMP-16)活性的抑制作用。方法根据抑制MMPs活性后底物降解速率降低的原理,通过检测底物降解速率,测定中药制半夏对MMP-16的抑制作用。结果与空白对照组及阳性对照组相比,制半夏具有较强的抑制MMP-16活性的作用,其抑制活性IC50=23 g/ml。结论半夏水煎剂在体外具有抑制MMP-16活性的作用,其抑制活性较强,且存在剂量依赖关系。 【关键词】 制半夏;
2、 基质金属蛋白酶; 酶活性分析; 抗肿瘤Abstract:ObjectiveTo study the inhibitory action of pinelliae tuber on matrix metalloproteinase-16 (MMP-16).MethodsThe decreasing of the degrade rate of substrate is associated with the inhibition of matrix metalloproteinase-16. We studied the inhibitory activity of pinelliae tub
3、er on MMP by observing the degrade rate of substrate. ResultsPinelliae tuber strongly inhibited the activity of MMP-16, and the IC50 was 23 g/ml.ConclusionThe apozem of pinelliae tuber has inhibitory activity on MMP-16 in a dose-dependent manner in vivo.Key words:Pinelliae tuber; Matrix metalloprote
4、inase; Methods for the analysis of enzymatic activity我国传统中药半夏Pinelliae tuber具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。长期的临床实践表明半夏具有确切的疗效。半夏生品有小毒,临床上内服必须经过炮制或与生姜配伍以减轻毒性,故本实验所用半夏均为临床应用广泛的炮制半夏。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类锌离子依赖的蛋白水解酶家族,能够降解细胞外基质成分,参与众多重要的生理和病理过程1。根据报道, MMPs活性的抑制对肿瘤细胞的行为有重要的影响24。本实验研究制半夏体外抑制基质金属蛋白酶16活性的作用及抗肿瘤机理,从而为从分子水平上
5、研究半夏的治病机理奠定基础,也为进一步从半夏中提取基质金属蛋白酶抑制剂提供实验依据。 1 器材 1.1 材料制半夏(吉林大学中日联谊 医院 中药房提供的道地药材),自制缓冲溶液(50mmol/L HEPES,0.2M NaCl,10 mmol/L CaCl2,20mol/L ZnSO4,0.05 % Brij-35),荧光底物DQ-gelatin(美国Sigma公司),已知广谱MMP的抑制药物15 nmol/L GM6001。1.2 仪器Bio-Red FLx-800荧光酶标仪(美国), DPX-9082B-1 点热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)。 2 原理与方法 2.1 原理实验所用
6、底物为荧光底物,酶降解底物后发荧光,通过荧光酶标仪检测反应体系的荧光强度变化。抑制活性的测定是在反应体系中加入半夏提取物,提取物中抑制成分与酶结合,占据酶的活性中心,使底物不能与酶结合,从而导致酶降解底物速率降低,荧光强度变化减慢。2.2 方法2.2.1 分组分为空白对照组(反应体系中不加入任何药物)、阳性对照组(反应体系中加入已知mmp抑制药物GM6001)、半夏水提物不同浓度组(加入不同浓度半夏水提物)。2.2.2 提取物的制备将3 g半夏放入水中沸水煮3 h,然后过滤得到水煮溶液,将水煮溶液低温冻干,得到半夏水提取物。配制浓度为0.4,1.2,2,2.8和3.6 mg/ml的水提取物溶液
7、。2.2.3 抑制活性的测定将一定量的MMP-16分别与1 l不同浓度的半夏水提取物(0.4,1.2,2,2.8和3.6 mg/ml)、1 l无菌蒸馏水、1 l 15nmol/L的GM6001加入96孔酶标板中,然后加入缓冲溶液(50mmol/L HEPES, 0.2 M NaCl,10 mmol/L CaCl2,20 mol/L ZnSO4, 0.05% Brij-35),使终体积为50 l,放入37培养箱中孵育30min,然后加入含有0.2 g DQ-gelatin的缓冲溶液50 l,最终反应体系为100 l,制半夏水提取物最终浓度分别为4,12,20,28和36 g/ml,立即用Bio-
8、Red FLx-800荧光酶标仪进行检测,激发波长为460 nmol/L发射波长为520 nM。检测10 min。检测的荧光强度变化就代表酶降解底物活力的强弱。2.2.4 抑制活性 计算 Vi代表加入抑制剂组的荧光强度变化,用Vo代表没有加入抑制剂组的荧光强度变化,抑制剂的抑制百分数用下边的公式计算:抑制百分数(%)=1-Vi/Vo ,当抑制百分数为50%时,则为此抑制剂抑制酶活性的IC50。 3 结果 图17分别是空白对照组与半夏水提物浓度分别为4,12,20,28和36 g/ml的实验组及阳性对照组的测定结果,图中“Mean V”表示随时间变化的荧光强度的变化速率,可
9、以作为相对的底物降解速率,根据实验方法中所给出的公式,能够 计算 出不同浓度的半夏提取物对MMP-16的抑制百分数。通过以上数据,能够推测MMP-16的活性抑制50%时所需要的半夏的量,见图8,IC50=23 g/ml。图1 空白对照组(略)图2 4g·ml-1半夏水提物的测定结果(略)图3 12g·ml-1半夏水提物的测定结果(略)图4 20g·ml-1半夏水提物的测定结果(略)图5 28g·ml-1半夏水提物的测定结果(略)图6 36g·ml-1半夏水提物的测定结果(略)图7 阳性对照组的测定结果(略)图8 不同浓度的制半夏抑制活性的分析(
10、略) 4 讨论 MMPs是锌肽酶家族的一员,是组成结缔组织细胞外基质降解过程中必不可少的酶,几乎能降解细胞外基质的所有成分,在体内多种生理和病理过程中起重要作用5。在创伤愈合、骨质再吸收、怀孕和分娩以及乳腺萎缩等与组织重塑有关的生理过程中均有MMPs的参与6,而在类风湿性关节炎、骨关节炎、角膜溃疡、牙周疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、神经退行性疾病如多发性梗塞等以细胞外基质过度破坏为主要特征的病理过程中MMPs亦发挥重要作用7。MMPs的表达和活化与肿瘤的生长、侵袭和转移呈正相关,在恶性肿瘤中MMPs经常过度表达8。基于此,MMPs已成为恶性肿瘤 治疗 的一个新靶点。 目前
11、几种广谱、低分子量的用于数种类型的肿瘤治疗的MMP抑制剂已被临床评估。虽然这些小分子药物在临床前的动物实验中能高效地抑制MMP的活性并有效地阻止肿瘤的生长和转移,但是其价格昂贵,并且在临床应用中表现出了强烈的副作用,最终导致后期临床的失败9。其原因可能在于这些抑制剂的特异性不强,对于许多其它种类的MMP的正常生理功能也起了不同程度的影响。因此,寻求高效的、特异性强的MMP抑制剂是这个领域当前工作的重点,也是目前国内外开发抗癌药物的热点。半夏在我国的临床应用 历史 悠久,价廉易得,成分分离工艺简便,药效记录多,安全性和毒副作用有验证,这些优势是合成化合物所无法比拟的。本实验表明,制半夏水煎液具有
12、抑制MMP-16活性的作用, 其抑制活性IC50=23g/ml,与空白及阳性对照组抑制活性相比后发现,在体外半夏抑制MMP-16活性的作用较强,且其抑制强度存在剂量依赖关系,水煎液的浓度越大,抑制作用越强。实验结果为从分子水平上研究半夏治疗相关疾病的机理奠定了基础,也为今后进一步从半夏中提取基质金属蛋白酶抑制剂并开发出以MMPs为靶点的中药新药提供了理论依据。 针对MMP-16的抑制效果已经完成,针对其他种类的MMPs的抑制效果仍有待进行,我们将以MMPs的抑制活性为指导,继续分离、鉴定出半夏中的MMPs抑制成分。【 参考 文献 】 1 Uta B. Hofmann, R
13、oland Houben, Eva-B,et al. Role of matrix metalloproteinases in melanoma cell invasionJ. Biochimie, 2005,87:307.2 Ming-Chung Jiang, Ching-Fong Liao , Po-Huang Lee. Aspirin Inhibits Matrix Metalloproteinase-2 Activity, Increases E-Cadherin Production, and Inhibits in Vitro Invasion of Tumor CellsJ. B
14、iochemical and Biophysical Research Communications, 2001:282, 671. 3 Ki-Tae Ha, Tae-Kyun Lee, Keum-Hwa Kwak,et al. Inhibitory effect of Cho-Deung-San on human aortic smooth muscle cell migration induced by TNF-a through inhibition of matrix metalloproteinase-2 and -9 activityJ. Vascular Pharmacology
15、,2004,41: 83.4 Risto Ala-aho,Veli-Matti Khri. Collagenases in cancerJ. Biochimie,2005,87: 273.5 陈华江,乇军杰.基质金属蛋白酶的结构及其调节机制J.国外医学·肿瘤学分册,2001,28(1):20.6 Kugler A.Matrix meta11oproteinases and their inhibitorsJ.Anticancer Res1999,19(2):15897 VeliMatti K,Saarialho-kere U. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in tumor growth and invasionJ. An
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