实验室微生物鉴定常见生化反应及应用价值

1、文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持实验室微生物鉴定常见生化反应及应用价值明胶液化试验(1) 原理：某些可以产生一种胞外蛋白水解酶(明胶酶)，能使明胶分解为氨基酸，使明胶失去凝固能力而液化，因而使半固体的明胶培养基成为流动的液体。(2) 方法：将待检菌接种于明胶培养基中，22 C培养7d或更长时间，每天观察结果有无凝固。(3) 结果：如无凝固，则表示明胶已被水解，液化试验阳性。如凝固，则继续培养。(4) 应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠 杆菌等到能液化明胶，肠杆菌科中的其它细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、 脆弱类杆菌等

2、也能液化明胶。另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化吲哚试验(靛基质试验)(1) 原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚 试剂(对二甲氨基苯甲醛)后则形成红色的玫瑰吲哚。(2) 培养基：蛋白胨水培养基。(3) 方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35 C孵育2448h ，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂，观察结果。(4) 结果：于两液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。(5) 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌 和产酸克雷伯菌等的鉴别。硫化氢试验(1) 原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢

3、遇亚铁离子或铅 离子则结合形成黑色沉淀物(硫化铁或硫化铅沉淀)。(2) 培养基：醋酸铅培养基。(3) 方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，于35 C孵育24h -48h ，观察有无黑色沉淀出现。(4) 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。(5) 应用：主要用于鉴别肠杆菌科中属及种的鉴别，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌 株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。尿素分解试验(1) 原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。(2) 培养基：尿素培养基。(3) 方法：将待检菌接种于尿素培养基

4、，于35 C孵育1824h 小时观察结果。(4) 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。(5) 应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌 脲酶阳性，另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。 苯丙氨酸脱氨酶试验(1) 原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸 脱氨后生成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。培 养基: 苯丙氨酸琼脂培养基。(3) 方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸琼脂培养基中，35 C孵育1824h ，滴加10%三氯化铁试剂34滴，自斜面上方流下。(4) 结果：有绿色出现为阳性

5、。应立即观察结果，延长反应时间会引起退色。(5) 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为 阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。氨基酸脱羧酶试验(1) 原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳。 由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。(2) 培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。(3) 方法：将待检菌分别接种于 1支氨基酸(赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸)脱羧酶试验管和 1支氨基酸脱羧酶对照管(无氨基酸)，各覆盖至少0.5cm 高度的无菌石蜡油，35 C孵育 14d，每日观察结果。(4) 结果：对照管应为黄色，若为溴甲酚紫指

6、示剂，则测定管呈紫色则为阳性，若测定 管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，不能做出判断。(5) 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。碳源和氮源利用试验是细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验。在枸橼酸盐培养基中，细菌只有利用枸橼酸盐作为碳源，分解生成碳酸钠使培养基变碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深蓝色。常用的试验方法有枸橼酸盐利用试验、丙二酸盐利用试验。枸橼酸盐利用试验(1) 原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼 酸盐生成

7、碳酸钠，使培养基变碱性。(2) 培养基：枸橼酸盐培养基。(3) 方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35 C孵育14d，逐日观察结果。(4) 结果：若用溴麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基由淡蓝色变蓝色为 阳性;不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，在此培养基上不能生长，培养基不变色，仍为绿 色为阴性。(5) 应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华 菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性。丙二酸盐利用试验(1) 原理：某些细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源，丙二酸盐被分解生成碳酸钠，使培 养基变碱(2) 培养基：丙二酸盐培养基。(3) 方法

8、：将待检菌接种于丙二酸盐培养基中，置35 C孵育2448h ，观察结果。(4) 结果：培养基由淡绿色变为蓝色为阳性。颜色无变化为阴性。(5) 应用：肠杆菌科中属间及种的鉴定。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其它各菌属均为阴性。氧化酶试验(1) 原理：氧化酶(即细胞色素氧化酶)，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。具有 氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。因此，本试验结果与细胞色素C的存在有关。方法：1) 菌落法：直接滴加试剂于被检菌落上。2) 滤纸法：取洁净滤纸一小块，蘸取菌少许，然后加试剂。

9、3) 试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。(3) 结果：细菌在与试剂接触 10秒内呈深紫色，为阳性。无色为阴性。为保证结果的 准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。(4) 应用：主要用于肠杆菌科细菌和假单胞菌属的鉴别，前者阴性，而后者阳性。奈瑟 菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。过氧化氢酶试验(触酶试验)(1) 原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子， 出现气泡。(2) 方法：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌， 加3%过氧化氢数滴，立即观察结果。(3) 结果：若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。(4) 应用：

10、革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故该试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。硝酸盐还原试验；二是在分解代谢过程中，硝酸盐硝酸盐还原过程可因细菌不同而异。有；有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离(1) 原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成代谢过程中，硝酸盐还原为亚硝 酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物 或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。如沙雷菌属；有的细菌还可以将其还原的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌等 子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮, 产物在合成性代谢中完全利用。(2) 培养基：硝酸盐培养基。(3) 方法：

11、将待检菌接种于硝酸盐培养基(内含小倒管)中，35 C孵育14d。将甲、乙等量混合液(用时混合)(约0.1ml)加于试管内，立即观察结果。(4) 结果：出现红色为阳性反应。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被 还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他物质而导致假阴性结果，这时应在试管内 加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表明试验为假阴性。若要观察是否有氮气产生，可于培养基管内加1只小导管，有气泡产生，则表示有氮气生成。(5) 应用：本试验广泛用于细菌鉴定。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌属均可产生氮气；有些厌氧菌

12、如韦荣菌等试验也为阳性。脂酶试验(1) 原理：有些细菌产生脂酶，可分解脂肪成游离的脂肪酸。在培养基中加入维多利亚蓝可与脂肪结合成为无色化合物，如果脂肪被分解，则维多利亚蓝被释放出来， 呈现深蓝色。(2) 培养基：含维多利亚蓝的脂酶培养基。(3) 方法：将待检菌接种于含维多利亚蓝的脂酶培养基中，置37 C孵育24h，观察结果。(4) 结果：培养基变为深蓝色者为阳性，阴性为无色或粉红色。(5) 应用：主要用于厌氧菌鉴定。 在类杆菌中的中间类杆菌产生脂酶，其它类杆菌阴性；在芽孢梭菌属中产芽胞梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也产生此酶，而其它梭菌为阴性。卵磷脂酶试验(1) 原理：有的细菌产生卵磷脂酶 (a-毒

13、素)，经钙离子作用，能迅速分解卵磷脂，形成 混浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。培 养基： 1%卵黄琼脂平板。(3) 方法：取待检菌划线接种或点种在卵黄琼脂平板上，置35 C孵育36h，观察结果。(4) 结果：3h后在菌落周围形成乳白色混浊环，即为卵磷脂酶试验阳性，6h后该混浊圈可扩大到直径 56mm。(5) 应用：该试验主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌和诺维梭菌为阳性，其他梭菌 为阴性。蜡样芽孢杆菌亦为阳性。凝固酶试验(1)原理：凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要试验。致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是与细胞壁结合的凝聚因子，称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使其变为纤维蛋

14、白，发生凝集，包围于细菌外面而凝聚成块，可用玻片法测出；另一种凝固酶是分泌至菌体外， 称为游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血浆凝固，可用试管法测出。(2) 方法： 玻片法：取兔血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的玻片中央，用接种环取待检菌分别与血浆和盐水混合。 试管法：取试管 2支，各加0.5ml人或兔血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分别加入 血浆中并均匀，置 37 C水浴3-4小时，每30min观察1次结果。(3) 结果： 玻片法：以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象为阳性。 试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。2h后无上述现象出现，则放置过夜后再

15、观察。(4) 应用：凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要试验，也是葡萄球鉴别时常用的试 验。CAMP试验(1)原理：B群链球菌(无乳链球菌)产生一种“ CAM”因子，可促进葡萄球菌的3-溶血素溶解红细胞的活性。因此，可在两种细菌(B群链球菌和葡萄球菌)的交界处溶血力增强，出现半月型透明溶血区。培 养基: 血琼脂平板。(3) 方法：在羊血或马血琼脂平板上，先以产3-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种。再将待检菌与前一划线作垂直接种，两者不能相交，应相距0.5-1cm ，于35 C孵育1824h观察结果。每次试验应做阴阳性对照。(4) 结果：两种细菌划线交接处出现箭头型溶血区为阳性。(5) 应用：

16、在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。其他链球菌均为阴性。胆汁溶菌试验(1)原理：胆汁或去氧胆酸钠能导致某些细菌溶解，一方面是由于胆汁或去氧胆酸钠降 低了细菌细胞膜上的表面张力，使细菌的细胞膜破损或使菌体裂解。另一方面可能是由于胆汁激活细菌体内的自溶酶，加速了细菌的自溶。方法： 试管法：用纯培养物制备1.8ml生理盐水浓菌悬液，pH调至7.0，分装两支试管，各0.9ml。其中一管加10%去氧胆酸钠为试验管，另一管加0.5ml生理盐水作对照。35 C 孵育10-30分钟，观察结果。 平板法：在血平板上选取单个可疑菌落，作好标记，直接在菌落上加1接种环10%去氧胆酸钠(P

17、H7.0)，置35 C孵育30min(平板不要翻转)观察结果。(3)结果： 试管法：以 加胆盐的培养物透明，而对照管仍混浊”为阳性。 平板法：如菌落消失，仅留下溶血区为阳性，菌落不消失为阴性。 应用：主要用于肺炎链球菌与甲型链球菌的鉴定，前者卫阳性，后者为阴性。O/129抑菌试验(1) 原理：0/129(二氨基喋啶)对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属无抑制作用。(2) 碱性琼脂平板。(3) 方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将0/129诊断纸片(含药40卩g/片)贴于平板上，置 35 C孵育1824h ，观察结果。(4) 结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环者为耐药。(5)

18、 应用：主要用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为敏感，气单胞菌属菌 为耐药。杆菌肽试验(4)结果：抑菌环直径大于10mm 为敏感，抑菌环直径小于 10mm 为耐药。(5) 应用：主要用于 A群链球菌与非 A群链球菌的鉴别。DNA酶试验(1) 原理：某些细菌能产生 DNA酶，可使长链DNA水解成为寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸则溶于酸。故在DNA琼脂平板上加盐酸后，可在菌落周围形成透明环。(2) 培养基：0.2%DNA 琼脂平板。(3) 方法：在DNA琼脂平板上点种待检菌，35 C孵育1824h ，用1mol/L盐酸倾注 平板，观察结果。(4) 结果：如菌落周围有透明环者为阳性，无透明环为阴性。(5) 应用：主要用于肠杆菌科及葡萄球菌属某些菌种的鉴定。在G+球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷菌、变形杆菌产生DNA酶，均为阳性。奥普托欣(Optochin) 试验(1)原理：Optochin(奥普托欣)是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。对肺炎链球菌有特异抑制作用，几乎所有肺炎链球菌对 Optochin 敏感，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成 作用，而对其它链球菌则无此作用。培 养基: 血琼脂平板。(3) 方法：用棉拭子将待检菌的肉汤